甲?；氖荏w和Ⅱ型膠原活化NSCs和BMSCs促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的體外研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱外科的嚴(yán)重疾病之一，年輕人發(fā)病多由于車(chē)禍等暴力損傷，而老年人發(fā)病多由于退變的頸椎間盤(pán)突出壓迫。損傷后常出現(xiàn)截癱、下肢神經(jīng)功能障礙甚至死亡。由于脊髓自身的神經(jīng)細(xì)胞再生能力有限，SCI發(fā)生后各種治療效果都顯得十分蒼白。椎間盤(pán)內(nèi)髓核組織主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原構(gòu)成。和神經(jīng)細(xì)胞一樣，軟骨細(xì)胞也存在自身增殖能力有限的缺點(diǎn)。椎間盤(pán)在變性后幾乎無(wú)法修復(fù)，從而失去力學(xué)支撐，突出在

2、椎管內(nèi)對(duì)脊髓產(chǎn)生壓迫。目前以手術(shù)減壓為代表的治療方法無(wú)論因暴力還是椎間盤(pán)突出所導(dǎo)致的脊髓壓迫都只能提供間接的治療，無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意的恢復(fù)效果。因此干細(xì)胞移植成為一種用于治療SCI的新手段。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有增殖、遷移以及分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和（或）少突膠質(zhì)細(xì)胞等功能，作為SCI后細(xì)胞移植治療用的主要載體。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)

3、定向分化為軟骨組織和細(xì)胞的能力，使其成為對(duì)椎間盤(pán)變性以及軟骨缺損的細(xì)胞移植治療用的主要載體。但在細(xì)胞移植后，干細(xì)胞的增殖、分化、遷移等轉(zhuǎn)歸問(wèn)題還有很多因素?zé)o法確定，成為束縛細(xì)胞移植治療效果的瓶頸所在。本文在體外通過(guò)甲?；氖荏w(formylpeptide receptors，F(xiàn)prs)和Ⅱ型膠原的作用下研究對(duì)SCI相關(guān)干細(xì)胞即NSCs和BMSCs的增殖、分化、遷移的影響，為SCI相關(guān)干細(xì)胞移植治療提供基礎(chǔ)理論支持。
　　第一部分:

4、Fprs對(duì)NSCs的增殖、遷移和分化的作用
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理狀態(tài)下，NSCs可以遠(yuǎn)距離的遷移到損傷部位，發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)損傷起到了一定的修復(fù)作用，但是NSCs如何遷移、到達(dá)局部后如何定向分化為功能性神經(jīng)元，其機(jī)制仍不明了。炎癥細(xì)胞易于通過(guò)趨化因子受體而遷移，NSCs是否也通過(guò)趨化因子受體而遷移？Fprs屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要在天然免疫和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，是經(jīng)典的趨化相關(guān)受體，主要表達(dá)于單核和中性粒細(xì)胞

5、上，也表達(dá)于肝臟等其他組織，近來(lái)被發(fā)現(xiàn)同樣表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦組織和脊髓組織中。但Fprs和NSCs之間是否有關(guān)聯(lián)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　我們根據(jù)文獻(xiàn)回顧的結(jié)果，設(shè)想Fprs和NSCs有關(guān)聯(lián)，并通過(guò)免疫熒光、蛋白印跡等方法檢測(cè)出NSCs能夠表達(dá)Fpr1和Fpr2。根據(jù)Fprs表達(dá)于NSCs的結(jié)果，通過(guò)Fprs的激動(dòng)劑和阻斷劑檢測(cè)其對(duì)NSCs的功能和發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Fprs可以促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化，并且能夠促進(jìn)NSCs

6、的遷移。本研究可加深Fpr1和Fpr2對(duì)內(nèi)源性NSCs的遷移和分化作用的認(rèn)識(shí)，為細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦缺血和SCI開(kāi)啟了一個(gè)全新的窗口。
　　目的:
　　探討甲?；氖荏w在體外對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及遷移的作用。
　　方法:
　　體外提取并培養(yǎng)原代NSCs，對(duì)其性狀進(jìn)行鑒定。分不同干預(yù)組(Fpr1激動(dòng)劑和阻斷劑、Fpr2激動(dòng)劑和阻斷劑)和空白對(duì)照組，分別作用于NSCs3d后，采用CCK-8法檢測(cè)各

7、組對(duì)NSCs活性的影響;免疫熒光法檢測(cè)不同組處理NSCs后，各組與空白對(duì)照組相比，DCX、GFAP、Olig2蛋白表達(dá)量的差異;蛋白印跡(Western Blotting，WB)法檢測(cè)不同組處理NSCs后，各組與空白對(duì)照組相比，DCX蛋白表達(dá)量的差異;形態(tài)學(xué)觀(guān)察和transwell法檢測(cè)，不同組處理NSCs后，各組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移數(shù)量的差異。
　　結(jié)果:
　　(1)通過(guò)免疫熒光和WB法驗(yàn)證了Fpr1和Fpr2存在于

8、NSCs上;(2)通過(guò)免疫熒光和WB法驗(yàn)證了Fpr1和Fpr2的激動(dòng)劑（fMLF和MMK-1）可促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化;(3)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和transwell法驗(yàn)證了Fpr1和Fpr2的激動(dòng)劑（fMLF和MMK-1）可促進(jìn)NSCs的遷移;(4)通過(guò)CCK-8法驗(yàn)證了Fpr1和Fpr2對(duì)NSCs的增殖無(wú)影響。
　　第二部分:Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞的作用
　　椎間盤(pán)變性突出的主要原因是軟骨細(xì)胞的變性和細(xì)胞外基

9、質(zhì)的水分丟失，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率隨之增加。由于解剖結(jié)構(gòu)的局限，軟骨細(xì)胞缺乏直接的血運(yùn)循環(huán)，損傷后自身修復(fù)或再生的能力非常有限。近年來(lái)越來(lái)越多的組織工程技術(shù)利用BMSCs的定向分化為軟骨組織和細(xì)胞的能力，并以此構(gòu)建為軟骨組織和細(xì)胞用于對(duì)軟骨缺損的治療已在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面都取得了極大的進(jìn)展。但如何能夠讓其定向分化為軟骨細(xì)胞并且發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)在現(xiàn)目前的研究中還是個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Ⅱ型膠原(CollagenⅡ，colⅡ)可由軟骨細(xì)胞

10、分泌合成，具有親和性強(qiáng)，能為軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及功能發(fā)揮近似于體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)作用的特點(diǎn)。研究表明Ⅱ型膠原在體內(nèi)和體外均可促進(jìn)BMSCs向骨細(xì)胞方向分化，并可促進(jìn)骨缺損的愈合，但其作為軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的研究少有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以Ⅱ型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)，體外研究Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向的分化作用，了解Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞的影響，以期Ⅱ型膠原作為仿生材料，用于損傷后軟骨的

11、修復(fù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　探討Ⅱ型膠原在體外促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的定向分化作用。
　　方法:
　　體外原代提取并培養(yǎng)BMSCs，對(duì)其性狀進(jìn)行鑒定。分不同colⅡ接種濃度組(25、50、100、200μg/ml)和空白對(duì)照組，分別作用于BMSCs7、14、21 d，采用CCK-8法檢測(cè)各不同濃度組和時(shí)間點(diǎn)對(duì)BMSCs活性的影響;qPCR法檢測(cè)不同濃度組處理BMSCs后，各濃度組與空白對(duì)照

12、組相比，CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan mRNA表達(dá)量的差異，免疫熒光法檢測(cè)不同濃度組處理BMSCs后，各濃度組與空白對(duì)照組相比，CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan蛋白表達(dá)量的差異。
　　結(jié)果:
　　(1) CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示各濃度組在7、14、21 dD(450)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2) qPCR檢測(cè)方法顯示21 d后，不同濃度組與空白對(duì)照組比較，CollagenⅡ、SOX9及Aggrec

13、an mRNA表達(dá)量均升高(p＜0.05)，以100μ g/ml組最高(p＜0.01);14 d時(shí)，各濃度組CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan mRNA以100μg/ml組上調(diào)最明顯(p＜0.05)，而在7d時(shí)，各組之間三者mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);(3)各濃度組21天時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示:在100μg/ml組CollagenⅡ、SOX9及Aggrecan蛋白的表達(dá)量較其他各組均明顯上調(diào)(p＜0.05)。

14、
　　綜上所述:本文通過(guò)免疫熒光法、WB法首次證實(shí)了Fpr1和Fpr2在NSCs上表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Fpr1和Fpr2的激動(dòng)劑可以促進(jìn)NSCs的遷移以及向神經(jīng)元方向的分化，而這種作用又可被其阻斷劑所抑制。表明Fprs表達(dá)于NSCs上，并且在NSCs的遷移及分化中起到了重要的作用。通過(guò)不同濃度組colⅡ干預(yù)BMSCs21d后，軟骨細(xì)胞標(biāo)志物（SOX9、Aggrecan及CollagenⅡ）mRNA水平和蛋白水平在100μg/ml組增高最明