督脈電針促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)中的特異性神經(jīng)肽及蛋白質(zhì)表達(dá)的研究.pdf

1、本研究旨在探討督脈電針(GV-EA)在治療全橫斷脊髓損傷(SCI)大鼠的過程中的特異性作用機(jī)理。通過對督脈電針治療脊髓損傷后脊髓組織內(nèi)特異性神經(jīng)肽和功能蛋白的檢測，從而了解電針治療在脊髓損傷后的神經(jīng)保護(hù)方面的分子機(jī)制，為祖國醫(yī)學(xué)在治療脊髓損傷時首選電針督脈建立可靠的理論基礎(chǔ)，并在蛋白水平上為脊髓損傷提供新的治療思路，本研究共分為三個部分。
　　 第一部分：督脈電針促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)中的穴位特異性蛋白表達(dá)的實驗研究
　　 目

2、的：檢測督脈電針在促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)過程中的差異蛋白的表達(dá)，為督脈電針的特異性作用機(jī)制提供實驗依據(jù)。
　　 方法：選用體重為200～250g的SD大鼠，隨機(jī)分為5組，正常對照組(normalgroup)，單純脊髓損傷組(SCI group)，督脈電針組(GV-EA+SCI group)，夾脊電針組(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位電針組(npa-EA+SCI group)。3組電針組大鼠在經(jīng)過T10脊髓節(jié)段全橫斷后7

3、d接受不同的電針治療，每天1次，每次電針20分鐘，于電針7d(新鮮取材)和30d(灌注取材)后取材。電針7d后的檢測分別取損傷區(qū)及其上下各1個節(jié)段的脊髓組織，先于-80℃凍存脊髓組織，樣品(組織提取液)溶解后開始進(jìn)行蛋白組學(xué)的各項檢測。經(jīng)二維凝膠電泳、計算機(jī)圖象分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理以及質(zhì)譜技術(shù)等步驟找出差異蛋白后，再做Western Blot、熒光免疫組化等后續(xù)實驗對蛋白組學(xué)檢測出的差異蛋白進(jìn)行定量及定位的分析。電針30d后的大鼠取L1

4、脊髓節(jié)段背核，切片做中性紅染色和熒光免疫組化檢測。
　　 結(jié)果：雙向電泳結(jié)果顯示，與單純SCI組和穴位對照組相比，GV-EA+SCI組大鼠脊髓組織中有4種具有神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白表達(dá)顯著增高，它們分別是塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白2(CRMP2)，膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)，熱休克蛋白27(HSP27)和腦磷脂結(jié)合蛋白1(PEBP1)。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步驗證了CRMP2和ANXA5在GV-EA組的相應(yīng)脊髓節(jié)段內(nèi)的表達(dá)顯著高于單

5、純SCI組和穴位對照組。免疫熒光雙標(biāo)法分析結(jié)果顯示，這4種差異蛋白在脊髓組織內(nèi)的神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有一定水平的表達(dá)。同時，我們中性紅染色結(jié)果顯示電針治療，尤其是督脈電針治療能夠促進(jìn)脊髓損傷后L1背核神經(jīng)元的存活，另外，L1背核神經(jīng)元內(nèi)發(fā)現(xiàn)有ANXA5和CRMP2兩種差異蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：ANXA5和CRMP2是GV-EA促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)過程中具有穴位特異性的蛋白質(zhì)，ANXA5和CRMP2可

6、能參與了督脈電針促進(jìn)背核神經(jīng)元存活的過程，從而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 第二部分：督脈電針促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)中特異性神經(jīng)肽的研究
　　 目的：本研究為了探尋督脈電針治療脊髓損傷后，損傷脊髓及其鄰近節(jié)段脊髓組織哪種神經(jīng)肽分泌增多，且這種有一定神經(jīng)保護(hù)作用的神經(jīng)肽具有電針特異性。
　　 方法：選用體重為200～250g的SD大鼠，隨機(jī)分為5組，正常對照組(normalgroup)，單純脊髓損傷組(SCI grou

7、p)，督脈電針組(GV-EA+SCI group)，夾脊電針組(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位電針組(npa-EA+SCI group)。3組電針組大鼠在經(jīng)過T10脊髓節(jié)段全橫斷后7d接受不同的電針治療，每天1次，每次電針20分鐘，于電針7d后取材。對脊髓損傷處及其鄰近的上下節(jié)段的脊髓進(jìn)行降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的Western Blot和免疫熒光組織化學(xué)檢測，觀察相應(yīng)節(jié)段脊髓組織內(nèi)CGRP的含量變化。
　　

8、 結(jié)果：1.Western Blot結(jié)果顯示，與SCI組相比，npa-EA組和Jiaji-EA組脊髓組織的CGRP含量都有所增高，均達(dá)到正常水平，而GV-EA組脊髓組織的CGRP含量高于正常水平，且與其它4組相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異。2.免疫熒光組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，CGRP在損傷鄰近節(jié)段脊髓背角的表達(dá)主要集中在第Ⅰ、Ⅱ板層，陽性反應(yīng)區(qū)占脊髓背側(cè)1/2面積的百分比在幾組中的比較與Western blot結(jié)果基本保持一致。
　　 結(jié)論

9、：從實驗設(shè)立SCI組、穴位對照組和非穴位對照組來看，GV-EA組脊髓CGRP的表達(dá)量都高于對照組。以上結(jié)果表明，CGRP是GV-EA治療SCI過程中特異性表達(dá)的一種神經(jīng)肽，該神經(jīng)肽具有一定的穴位特異性，GV-EA可能是通過對CGRP的表達(dá)調(diào)節(jié)來激發(fā)損傷脊髓組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)再生的。
　　 第三部分：降鈣素基因相關(guān)肽CGRP對體外受損傷的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元存活的影響
　　 目的：本章實驗欲通過檢測CGRP對體外培養(yǎng)的受損

10、傷的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元存活及其ANXA5和CRMP2表達(dá)的影響，來間接證實CGRP促進(jìn)受損傷神經(jīng)元存活的作用和CGRP與兩種差異蛋白(ANXA5和CRMP2)之問的關(guān)系。
　　 方法：出生7～8 d的SD乳鼠，小心地分離出小腦組織，經(jīng)胰酶、DNA酶消化后，細(xì)胞按每毫升1.5×106個的密度接種在多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中(本實驗選用的是6孔板，且孔板里放有蓋玻片)，培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元。在神經(jīng)元培養(yǎng)至7～8d胞體成熟、突起豐富的

11、時候，建立劃痕損傷模型，損傷同時加入一定劑量(10-6M和10-7M)的CGRP，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞之前的1h加2μM calceinAM(標(biāo)記活細(xì)胞)和4μM EthD-Ⅲ(標(biāo)記死亡細(xì)胞)，加之后在37℃下孵育1h，然后在熒光顯微鏡下觀察和計數(shù)，其中calcein AM標(biāo)記的活細(xì)胞在鏡下顯綠色，EthD-Ⅲ標(biāo)記的死亡細(xì)胞在鏡下顯紅色。另外，對損傷組、加入CGRP的損傷組及正常的小腦顆粒神經(jīng)元還做了ANXA5/CRMP2跟Hoech

12、st33342的雙標(biāo)檢測，間接反映CGRP與差異蛋白ANXA5/CRMP2的關(guān)系。
　　 結(jié)果：通過對各組小腦顆粒神經(jīng)元存活率的檢測，結(jié)果顯示，跟正常組相比，單純損傷組神經(jīng)元的存活率明顯降低，不管是損傷后1h、6h還是12h組：同時加CGRP的損傷組神經(jīng)元的存活率盡管遠(yuǎn)不及正常組，但是跟單純損傷組相比從6h開始存活率已經(jīng)開始增高，持續(xù)到損傷后12h仍然高于損傷組。另外，CGRP的兩個劑量(10-6M和10-7M)組之間在相應(yīng)時間

13、段對神經(jīng)元存活率的影響沒有明顯差異。經(jīng)過對normal組、injury組(6h)和injury(6h)+CGRP(10-7M)組小腦顆粒神經(jīng)元中ANXA5和CRMP2陽性細(xì)胞百分率的統(tǒng)計處理，含有10-7M CGRP的損傷組，跟injury(6h)組相比，兩種蛋白的陽性細(xì)胞百分率沒有明顯變化。
　　 結(jié)論：在GV-EA治療SCI的過程中產(chǎn)生的特異性神經(jīng)肽CGRP具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過促進(jìn)受損傷神經(jīng)元的存活，從而有助于