甲酰基肽受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移在脊髓損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是脊柱外科常見的嚴(yán)重疾病之一，發(fā)病率逐年增加，發(fā)病原因主要包括運(yùn)動(dòng)傷、跌倒、交通事故和暴力傷害等所致。SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)很差，常引起脊髓損傷節(jié)段以下的肢體嚴(yán)重的功能障礙，嚴(yán)重影響患者的神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。SCI的高發(fā)人群為中青年，該年齡段是社會(huì)的主要?jiǎng)趧?dòng)力，往往給其家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床治療脊髓損傷的主要方法是通過使用甲強(qiáng)龍減輕損傷后炎癥的發(fā)生和發(fā)展，預(yù)防二次損傷

2、以及防治細(xì)胞變性和壞死。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，過度的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的主要原因，不良的炎性微環(huán)境是限制神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。但是，SCI后局部的保護(hù)性免疫反應(yīng)亦能清除局部組織碎片和毒性代謝產(chǎn)物，為SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)提供良好的微環(huán)境，能夠促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的再生。因此，免疫反應(yīng)在SCI的病理生理過程中起著雙刃劍的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞(Micmglia)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)的固有免疫細(xì)胞，是CN

3、S最重要的免疫防線。作為炎癥細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷后局部的聚集和吞噬功能，對(duì)于SCI預(yù)后有重要的影響。小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的定向遷移，是通過G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)與病原體或自身來源的趨化因子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。如何調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移是研究的關(guān)鍵，而甲?；氖荏w(Formyl-peptide Receptors，F(xiàn)PRs)是GPCR家族成員之一，是具有趨化炎癥細(xì)胞遷移功能的受體。

4、因此，F(xiàn)PRs在小膠質(zhì)細(xì)胞遷移中是否作用，是否能夠促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)？
　　目的：
　　本研究以Fpr1(Forrnyl-peptide receptor1，F(xiàn)pr1)和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞為切入點(diǎn)，通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)BV-2細(xì)胞能夠表達(dá)Fpr1，而Fpr1能夠特異性地介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。同時(shí)，F(xiàn)pr1特異性激動(dòng)劑fMLP(formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine，fMLP)

5、可上調(diào)BV-2細(xì)胞中Fpr1表達(dá)水平，以及該作用是通過活化ERK(Extracellular RegulatedProtein Kinases，ERK)信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：
　　1.小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞的培養(yǎng)及Fpr1表達(dá)鑒定
　　將小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞在含10％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的改良型RMPI1640培養(yǎng)基中，37℃、5％ CO2孵育箱中培養(yǎng)。待BV-2細(xì)胞不斷增殖且鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)，用胰酶消化

6、懸浮和離心后，分瓶進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。為了明確小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞Fpr1的表達(dá)，在激光共聚焦培養(yǎng)皿中接種BV-2細(xì)胞后進(jìn)行Fpr1的免疫熒光(Immunofluorescence，IF)染色鑒定。
　　2.fMLP對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的影響
　　為了確定Fpr1對(duì)于小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞遷移的影響，將培養(yǎng)的BV-2細(xì)胞消化、離心和計(jì)數(shù)后，按加入不同濃度的fMLP分為6組，0 nmol/L對(duì)照組，1 nmol/L

7、組、10 nmol/L組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、500 nmol/L組，接種于Transwell小室干預(yù)48h后，采用結(jié)晶紫染色法觀察Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的影響。
　　3.Fpr1受體在BV-2細(xì)胞遷移中的作用
　　為了明確Fpr1在BV-2細(xì)胞遷移中作用，我們采用Transwell法，把BV-2細(xì)胞隨即分為對(duì)照組、100nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μ mol/L Boc-MLF(Boc

8、-peptidesN-formyl-Met-Leu-Phe)阻斷劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑+100nmol/L fMLP激動(dòng)劑組，其中Fpr1特異性阻斷劑Boc-MLF干預(yù)20 min后，觀察Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的特異性作用，并且明確其作用是否能被Fpr1特異性阻斷劑所抑制。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Fpr1對(duì)BV-2細(xì)胞遷移的作用
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證和明確Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移的作用，采用劃痕實(shí)

9、驗(yàn)，把BV-2細(xì)胞同樣分為對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組，來確定Fpr1對(duì)于BV-2細(xì)胞遷移作用的特異性。
　　5.fMLP和Boc-MLF對(duì)于BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白表達(dá)的影響
　　為了檢測fMLP和Boc-MLF對(duì)于BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白表達(dá)量的影響，將BV-2細(xì)胞按不同干預(yù)因素處

10、理，分對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組，用Western blot法檢測細(xì)胞中Fpr1蛋白的表達(dá)水平變化。
　　6.ERK信號(hào)通路在Fpr1調(diào)節(jié)BV-2細(xì)胞遷移中的作用
　　為了探尋Fpr1在調(diào)節(jié)BV-2細(xì)胞遷移中可能的分子機(jī)制，按不同干預(yù)因素處理，分對(duì)照組、100 nmol/L fMLP激

11、動(dòng)劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μ mol/LBoc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動(dòng)劑組，分別處理20 min后，采用Western blot法檢測各組ERK蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞表達(dá)Fpr1
　　使用倒置相差顯微鏡觀察BV-2細(xì)胞狀態(tài)顯示:BV-2細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)良好，輪廓清晰，培養(yǎng)基清澈。此外，免疫熒光染色結(jié)果顯示:小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV

12、-2表達(dá)Fpr1陽性。
　　2.Fpr1能夠誘發(fā)BV-2細(xì)胞的遷移
　　Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:采用不同濃度的Fpr1特異性激動(dòng)劑fMLP(1nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L)分組進(jìn)行干預(yù)48h后，使用倒置顯微鏡觀察，可見隨著fMLP濃度的增高，從Transwell上室穿透到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著高于空白對(duì)照組，且具有明顯的濃度依賴性，其中100 n

13、mol/L組和500 nmol/L組效果最顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.Fpr1促進(jìn)BV-2細(xì)胞遷移作用具有特異性
　　劃痕實(shí)現(xiàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，100 nmol/L的fMLP能夠顯著增強(qiáng)BV-2細(xì)胞的遷移能力，并且其促進(jìn)遷移的作用能被Boc-MLF所抑制。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Fpr1促進(jìn)BV-2細(xì)胞遷移的作用，再次采用Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)，其結(jié)果也顯示:100 nmol/

14、L的fMLP能夠顯著增強(qiáng)BV-2細(xì)胞的遷移能力，并且其促進(jìn)遷移的效應(yīng)能被Boc-MLF所抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，共同表明了Fpr1受體在BV-2細(xì)胞遷移中具有重要的作用。
　　4.fMLP可以上調(diào)BV-2細(xì)胞中Fpr1蛋白的表達(dá)量
　　各組細(xì)胞經(jīng)上訴方法分別干預(yù)90 min后，Western blot檢測結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，fMLP組Fpr1蛋白表達(dá)水平顯著升高;Boc-MLF+fMLP

15、組的Fpr1蛋白表達(dá)水平相比fMLP組則又降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明fMLP可以上調(diào)BV-2細(xì)胞Fpr1蛋白的表達(dá)水平。
　　5.fMLP通過活化ERK信號(hào)通路促進(jìn)BV-2細(xì)胞的遷移
　　各組細(xì)胞經(jīng)分別干預(yù)20 min后，Western blot檢測結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，fMLP組p-ERK蛋白表達(dá)水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Boc-MLF+fMLP組的p-ERK蛋白表達(dá)水平相比fM