甲?；氖荏w調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞遷移在脊髓損傷中的作用及機制研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是脊柱外科常見的嚴重疾病之一，發(fā)病率逐年增加，發(fā)病原因主要包括運動傷、跌倒、交通事故和暴力傷害等所致。SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)很差，常引起脊髓損傷節(jié)段以下的肢體嚴重的功能障礙，嚴重影響患者的神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。SCI的高發(fā)人群為中青年，該年齡段是社會的主要勞動力，往往給其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。臨床治療脊髓損傷的主要方法是通過使用甲強龍減輕損傷后炎癥的發(fā)生和發(fā)展，預(yù)防二次損傷

2、以及防治細胞變性和壞死。傳統(tǒng)觀點認為，過度的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的主要原因，不良的炎性微環(huán)境是限制神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。但是，SCI后局部的保護性免疫反應(yīng)亦能清除局部組織碎片和毒性代謝產(chǎn)物，為SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)提供良好的微環(huán)境，能夠促進損傷后神經(jīng)元的再生。因此，免疫反應(yīng)在SCI的病理生理過程中起著雙刃劍的作用。小膠質(zhì)細胞(Micmglia)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)的固有免疫細胞，是CN

3、S最重要的免疫防線。作為炎癥細胞，小膠質(zhì)細胞在脊髓損傷后局部的聚集和吞噬功能，對于SCI預(yù)后有重要的影響。小膠質(zhì)細胞等炎癥細胞的定向遷移，是通過G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor, GPCR)與病原體或自身來源的趨化因子結(jié)合而實現(xiàn)的。如何調(diào)控小膠質(zhì)細胞的遷移是研究的關(guān)鍵，而甲?；氖荏w(Formyl-peptide Receptors，F(xiàn)PRs)是GPCR家族成員之一，是具有趨化炎癥細胞遷移功能的受體。

4、因此，F(xiàn)PRs在小膠質(zhì)細胞遷移中是否作用，是否能夠促進脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)？
　　目的：
　　本研究以Fpr1(Forrnyl-peptide receptor1，F(xiàn)pr1)和小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞為切入點，通過一系列實驗證實BV-2細胞能夠表達Fpr1，而Fpr1能夠特異性地介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞遷移。同時，F(xiàn)pr1特異性激動劑fMLP(formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine，fMLP)

5、可上調(diào)BV-2細胞中Fpr1表達水平，以及該作用是通過活化ERK(Extracellular RegulatedProtein Kinases，ERK)信號通路而實現(xiàn)的。
　　方法：
　　1.小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞的培養(yǎng)及Fpr1表達鑒定
　　將小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞在含10％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的改良型RMPI1640培養(yǎng)基中，37℃、5％ CO2孵育箱中培養(yǎng)。待BV-2細胞不斷增殖且鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，用胰酶消化

6、懸浮和離心后，分瓶進行細胞傳代培養(yǎng)。為了明確小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞Fpr1的表達，在激光共聚焦培養(yǎng)皿中接種BV-2細胞后進行Fpr1的免疫熒光(Immunofluorescence，IF)染色鑒定。
　　2.fMLP對于BV-2細胞遷移的影響
　　為了確定Fpr1對于小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞遷移的影響，將培養(yǎng)的BV-2細胞消化、離心和計數(shù)后，按加入不同濃度的fMLP分為6組，0 nmol/L對照組，1 nmol/L

7、組、10 nmol/L組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、500 nmol/L組，接種于Transwell小室干預(yù)48h后，采用結(jié)晶紫染色法觀察Fpr1對于BV-2細胞遷移的影響。
　　3.Fpr1受體在BV-2細胞遷移中的作用
　　為了明確Fpr1在BV-2細胞遷移中作用，我們采用Transwell法，把BV-2細胞隨即分為對照組、100nmol/L fMLP激動劑組、5μ mol/L Boc-MLF(Boc

8、-peptidesN-formyl-Met-Leu-Phe)阻斷劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑+100nmol/L fMLP激動劑組，其中Fpr1特異性阻斷劑Boc-MLF干預(yù)20 min后，觀察Fpr1對于BV-2細胞遷移的特異性作用，并且明確其作用是否能被Fpr1特異性阻斷劑所抑制。
　　4.劃痕實驗檢測Fpr1對BV-2細胞遷移的作用
　　為了進一步驗證和明確Fpr1對于BV-2細胞遷移的作用，采用劃痕實

9、驗，把BV-2細胞同樣分為對照組、100 nmol/L fMLP激動劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μmol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動劑組，來確定Fpr1對于BV-2細胞遷移作用的特異性。
　　5.fMLP和Boc-MLF對于BV-2細胞中Fpr1蛋白表達的影響
　　為了檢測fMLP和Boc-MLF對于BV-2細胞中Fpr1蛋白表達量的影響，將BV-2細胞按不同干預(yù)因素處

10、理，分對照組、100 nmol/L fMLP激動劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動劑組，用Western blot法檢測細胞中Fpr1蛋白的表達水平變化。
　　6.ERK信號通路在Fpr1調(diào)節(jié)BV-2細胞遷移中的作用
　　為了探尋Fpr1在調(diào)節(jié)BV-2細胞遷移中可能的分子機制，按不同干預(yù)因素處理，分對照組、100 nmol/L fMLP激

11、動劑組、5μ mol/L Boc-MLF阻斷劑組、5μ mol/LBoc-MLF阻斷劑+100 nmol/L fMLP激動劑組，分別處理20 min后，采用Western blot法檢測各組ERK蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞表達Fpr1
　　使用倒置相差顯微鏡觀察BV-2細胞狀態(tài)顯示:BV-2細胞呈貼壁生長，形態(tài)良好，輪廓清晰，培養(yǎng)基清澈。此外，免疫熒光染色結(jié)果顯示:小鼠小膠質(zhì)細胞系BV

12、-2表達Fpr1陽性。
　　2.Fpr1能夠誘發(fā)BV-2細胞的遷移
　　Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示:采用不同濃度的Fpr1特異性激動劑fMLP(1nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L)分組進行干預(yù)48h后，使用倒置顯微鏡觀察，可見隨著fMLP濃度的增高，從Transwell上室穿透到下室的細胞數(shù)量顯著高于空白對照組，且具有明顯的濃度依賴性，其中100 n

13、mol/L組和500 nmol/L組效果最顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.Fpr1促進BV-2細胞遷移作用具有特異性
　　劃痕實現(xiàn)結(jié)果顯示:與對照組相比，100 nmol/L的fMLP能夠顯著增強BV-2細胞的遷移能力，并且其促進遷移的作用能被Boc-MLF所抑制。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了進一步驗證Fpr1促進BV-2細胞遷移的作用，再次采用Transwell細胞遷移試驗，其結(jié)果也顯示:100 nmol/

14、L的fMLP能夠顯著增強BV-2細胞的遷移能力，并且其促進遷移的效應(yīng)能被Boc-MLF所抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果與細胞劃痕實驗結(jié)果相一致，共同表明了Fpr1受體在BV-2細胞遷移中具有重要的作用。
　　4.fMLP可以上調(diào)BV-2細胞中Fpr1蛋白的表達量
　　各組細胞經(jīng)上訴方法分別干預(yù)90 min后，Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，fMLP組Fpr1蛋白表達水平顯著升高;Boc-MLF+fMLP

15、組的Fpr1蛋白表達水平相比fMLP組則又降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明fMLP可以上調(diào)BV-2細胞Fpr1蛋白的表達水平。
　　5.fMLP通過活化ERK信號通路促進BV-2細胞的遷移
　　各組細胞經(jīng)分別干預(yù)20 min后，Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，fMLP組p-ERK蛋白表達水平較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); Boc-MLF+fMLP組的p-ERK蛋白表達水平相比fM