AQP1在大鼠雪旺氏細(xì)胞及面神經(jīng)水腫中表達(dá)調(diào)控機制的實驗研究.pdf

1、[研究背景]:
　　解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)走行于顳骨部的面神經(jīng)由于通過堅硬狹窄的骨性面神經(jīng)管，在損傷后水腫缺血不能及時緩解，最終導(dǎo)致變性壞死，出現(xiàn)不同程度的面神經(jīng)癱瘓。由于目前缺乏理想的治療手段，所以研究面神經(jīng)水腫發(fā)生機制，找到水腫損傷形成和持續(xù)的方法，避免面神經(jīng)進一步變性壞死是面神經(jīng)損傷治療的方向之一。
　　水通道蛋白(AQPs)是一類高效介導(dǎo)跨膜水轉(zhuǎn)運的特異性通道蛋白，在水液代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用，參與人體多種組織器官水腫的形成

2、和消除。前期通過動物面神經(jīng)損傷模型的研究，AQP1在面神經(jīng)組織上表達(dá)趨勢與神經(jīng)水腫程度相似，且主要定位于雪旺氏細(xì)胞上，調(diào)控其表達(dá)可調(diào)節(jié)雪旺氏細(xì)胞的腫脹程度。根據(jù)研究報道乙酰唑胺能有效抑制AQP1的表達(dá)，我們也在前期工作中證實乙酰唑胺對雪旺氏細(xì)胞表達(dá)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但是對于AQP1在雪旺氏細(xì)胞和面神經(jīng)水腫形成過程中的表達(dá)調(diào)控機制，目前尚無研究報道。
　　由于目前缺乏從整體水平對AQPs的功能及其表達(dá)調(diào)控機制進行研究，因此，結(jié)合前期研

3、究基礎(chǔ)，本課題通過對雪旺氏細(xì)胞水腫模型和面神經(jīng)損傷動物模型的研究，運用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等實驗方法分別在體外和體內(nèi)研究水腫狀態(tài)下AQP1的表達(dá)調(diào)控機制及乙酰唑胺干預(yù)條件下對AQP1的調(diào)控機制，并探討其相互之間的關(guān)系，為治療早期面神經(jīng)水腫提供全新的方向。
　　[目的]:
　　1、研究AQP1表達(dá)變化與雪旺氏細(xì)胞水腫的關(guān)系及其表達(dá)調(diào)控機制;
　　2、研究乙酰唑胺對AQP1表達(dá)調(diào)控與雪旺氏細(xì)胞水腫之間的關(guān)系;
　　

4、3、在面神經(jīng)損傷動物模型上進一步驗證調(diào)控AQP1表達(dá)導(dǎo)致面神經(jīng)水腫的相關(guān)機制，為臨床以水通道蛋白為靶點預(yù)防或治療早期面神經(jīng)水腫提供新思路。
　　[方法]:
　　一、滲透壓改變對雪旺氏細(xì)胞AQP1表達(dá)的影響及其表達(dá)調(diào)控的實驗研究
　　1、低滲液對大鼠雪旺氏細(xì)胞生物學(xué)特性及AQP1表達(dá)變化的影響
　　A.RSC96大鼠雪旺氏細(xì)胞系培養(yǎng)及鑒定
　　(1)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)觀察;
　　(2)免疫熒光雙標(biāo)染

5、色:S-100（雪旺氏細(xì)胞特異性標(biāo)志物）及AQP1表達(dá);
　　(3)蛋白質(zhì)印跡法檢測雪旺氏細(xì)胞中AQP1表達(dá)。
　　B.構(gòu)建低滲細(xì)胞水腫模型
　　(1)2組低滲液240mmol/L、150 mmol/L誘導(dǎo)細(xì)胞水腫;
　　(2) CCK-8細(xì)胞活力檢測及流式細(xì)胞早期凋亡評估模型標(biāo)準(zhǔn)及時間點;
　　(3)低滲誘導(dǎo)細(xì)胞水腫形態(tài)變化及confocal動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞體積變化;
　　(4)免疫熒光及Western

6、-blot檢測細(xì)胞水腫AQP1表達(dá)變化。
　　2、滲透壓改變對雪旺氏細(xì)胞MAPK信號通路的影響
　　(1)復(fù)制細(xì)胞水腫模型;
　　(2)細(xì)胞水腫模型分組:2組低滲液240mmol/L、150 mmol/L，對照組以常規(guī)無血清DMEM培養(yǎng);
　　(3) Western-blot檢測MAPK各亞組蛋白磷酸化水平變化。
　　3、MAPK在雪旺氏細(xì)胞水腫中對AQP1表達(dá)調(diào)控的實驗研究
　　(1)復(fù)制細(xì)胞水腫模

7、型;
　　(2)細(xì)胞水腫模型分組:ERK/p38組;對照組，模型組，抑制劑干預(yù)組，干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后，再加入低滲液體;
　　(3) Western-blot檢測AQP1表達(dá)變化。
　　二、乙酰唑胺對大鼠雪旺氏細(xì)胞AQP1表達(dá)調(diào)控的初步研究
　　1、慢病毒介導(dǎo)的AQP1過表達(dá)對大鼠雪旺氏細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實驗研究
　　(1) AQP1過表達(dá)構(gòu)建:將目的基因克隆到慢病毒載

8、體，鑒定克隆正確連接（PCR和測序），過表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞制備AQP1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株模型;
　　(2)細(xì)胞周期測定過表達(dá)細(xì)胞與陰性對照細(xì)胞差異;
　　(3)免疫熒光半定量及蛋白質(zhì)印跡法檢測感染后雪旺氏細(xì)胞AQP1蛋白表達(dá)變化。
　　2、乙酰唑胺AZA抑制AQP1表達(dá)與MAPK信號級聯(lián)之間的實驗研究
　　(1)利用CCK-8檢測乙酰唑胺對雪旺氏細(xì)胞毒性，篩選合適的藥物濃度;

9、r>　　(2)不同濃度梯度的AZA作用于過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株(OE)，Western-blot檢測干預(yù)12h后AQP1蛋白變化情況;
　　(3) AZA干預(yù)AQP1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，免疫印跡法觀察0-12h MAPK蛋白磷酸化變化水平;
　　(4)細(xì)胞分為正常對照組，乙酰唑胺抑制組，乙酰唑胺抑制干預(yù)組，干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后，再加入乙酰唑胺干預(yù)12h，觀察AQP1蛋白變化情況。
　　3、AZA對

10、AQP1表達(dá)變化的穿梭機制研究
　　(1)利用構(gòu)建的OE進行免疫沉淀(IP)，將沉淀的蛋白液行質(zhì)譜分析，篩選可能與AQP1互相作用的細(xì)胞骨架蛋白(MYH14)及泛素蛋白(Ub);利用免疫熒光共標(biāo)染色驗證AQP1與MYH14、Ub細(xì)胞內(nèi)共定位;重復(fù)IP試驗，驗證乙酰唑胺干預(yù)下AQP1與MYH14的相互作用;
　　(2) AZA干預(yù)OE12h，利用膜蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞膜及細(xì)胞漿蛋白，免疫印跡法觀察AZA干預(yù)后AQP1轉(zhuǎn)位表達(dá)

11、情況;
　　(3) MYH14-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:將目的基因克隆到慢病毒載體，鑒定克隆正確連接（PCR和測序），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞，構(gòu)建的MYH14-shRNA利用免疫熒光觀察轉(zhuǎn)染效率，免疫印跡驗證MYH14蛋白敲除水平;
　　(4) MYH14-shRNA對細(xì)胞活力影響及泛素化抑制劑MG132藥物濃度行CCK-8檢測;
　　(5)細(xì)胞分為正常對照組，AZA抑制組，AZA抑制干預(yù)組，干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先敲除M

12、YH14，再加入AZA，觀察AQP1蛋白轉(zhuǎn)位變化情況;
　　(6)細(xì)胞分組正常對照組，乙酰唑胺抑制組，泛素抑制劑組、泛素抑制劑+乙酰唑胺干預(yù)組，干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先MG132處理1h，再加入AZA，觀察AQP1蛋白變化情況。
　　三、AQP1在面神經(jīng)水腫中的表達(dá)調(diào)控及治療機制的實驗研究
　　1、大鼠面神經(jīng)損傷模型的構(gòu)建及評估
　　(1)耳后切口入路構(gòu)建大鼠面神經(jīng)損傷模型:Wistar大鼠左側(cè):手術(shù)側(cè)，右側(cè):自身

13、對照側(cè);術(shù)后14天，對面神經(jīng)核團區(qū)的腦干部位連續(xù)冰凍切片，對核團神經(jīng)元計數(shù);對面神經(jīng)功能評分;
　　(2)解剖獲取面神經(jīng)顳骨段面神經(jīng)組織進行組織切片，免疫組化觀察AQP1的分布和表達(dá)，判斷AQP1的時相性變化;
　　(3)免疫印跡法對顳骨段面神經(jīng)組織內(nèi)的AQP1蛋白的表達(dá)進行檢測，驗證AQP1蛋白水平的時相性變化趨勢;
　　2、面神經(jīng)損傷對大鼠面神經(jīng)組織MAPK信號通路的影響
　　(1)重復(fù)構(gòu)建動物模型，免疫印跡

14、法檢測面神經(jīng)水腫形成時間內(nèi)MAPK蛋白磷酸化變化情況;
　　(2)動物模型分組，MAPK抑制劑篩選濃度驗證體內(nèi)ERK/p38抑制水平;
　　3、MAPK在面神經(jīng)水腫中對AQP1表達(dá)調(diào)控的實驗研究
　　動物模型分為ERK/p38兩組:正常對照組，模型組，模型干預(yù)組，抑制劑空白對照組，干預(yù)組及抑制劑空白對照組術(shù)前給予預(yù)實驗中摸索的藥物濃度及給藥方式，手術(shù)造模，免疫印跡法觀察AQP1蛋白變化情況;
　　四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分

15、析獲得結(jié)果，為后續(xù)研究開辟思路。
　　[結(jié)果]:
　　1、RSC96大鼠雪旺氏細(xì)胞表達(dá)AQP1，在不同滲透壓誘導(dǎo)下，細(xì)胞水腫形成，AQP1均于6h達(dá)高峰（150mM: P＜0.001，240mM: P＜0.01）;
　　2、不同濃度的低滲溶液作用后均能激活p-ERK和p-p38蛋白磷酸化水平;150mmol/L組:p-ERK在30min時表達(dá)最強(P＜0.001)，p-p38在1h時表達(dá)最強(P＜0.001);240m

16、mol/L組:p-ERK在15min時達(dá)最強(P＜0.001)，p-p38在5min時達(dá)最強(P＜0.001)。ERK抑制劑U0126中，兩組低滲濃度組AQP1表達(dá)較低滲刺激組均明顯降低(150mmol/L:P＜0.05;240mmol/L: P＜0.001)，與對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達(dá)較低滲處理降低(150mmol/L:P＜0.05;240mmol/L:P＜0.001)，但仍高于正常對照組

17、水平(P＜0.01)。
　　3、構(gòu)建的AQP1過表達(dá)載體測序正確，轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞后AQP1蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.001);乙酰唑胺干預(yù)12h后，蛋白水平明顯降低(10-5mol/L:P＜0.001，10-6mol/L:P＜0.01)，AQP1下調(diào)呈濃度依賴性（10-5:10-6mol/L:P＜0.05）;
　　4、乙酰唑胺干預(yù)細(xì)胞0-12h，p-ERK磷酸化水平6h表達(dá)最強(P＜0.001)。ERK抑制劑U0126作用于

18、細(xì)胞后，能明顯阻斷乙酰唑胺對AQP1的抑制作用(P＜0.05);
　　5、MYH14-shRNA質(zhì)粒測序正確，轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞后MYH14蛋白水平下降(P＜0.01)，并對雪旺氏細(xì)胞活力無影響;
　　6、乙酰唑胺干預(yù)細(xì)胞后，激活MAPK信號通路，下游細(xì)胞骨架蛋白MYH14與AQP1相互作用，從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，1h時表達(dá)量最高(P＜0.01)，MYH14-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，AQP1轉(zhuǎn)位現(xiàn)象消失，膜AQP1表達(dá)下調(diào)(P＜0

19、.05);
　　7、細(xì)胞預(yù)處理MG132，泛素蛋白酶體通路被抑制，AZA對AQP1抑制作用消失(P＜0.001)，證明AZA通過AQP1轉(zhuǎn)位在細(xì)胞膜上激活泛素通路而降解;
　　8、大鼠面神經(jīng)損傷行為學(xué)觀察，面神經(jīng)功能評分均符合面癱指標(biāo)，面神經(jīng)核團計數(shù)低于對照側(cè)(P＜0.05);免疫組化及免疫印跡分析均在術(shù)后7d AQP1表達(dá)最高(P＜0.001);
　　9、面神經(jīng)損傷后大鼠體內(nèi)激活ERK/p38信號通路，p-ERK/p

20、-p38均在術(shù)后3d時達(dá)最強(P＜0.001)，ERK抑制劑U0126，抑制劑干預(yù)組AQP1表達(dá)模型組降低(P＜0.001)，與對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達(dá)較模型組降低(P＜0.001)，結(jié)論同細(xì)胞學(xué)水平類似，說明MAPK信號通路有可能參與面神經(jīng)水腫形成中對AQP1表達(dá)調(diào)控。
　　[結(jié)論]:
　　1、AQP1參與雪旺氏細(xì)胞水腫形成;
　　2、MAPK在低滲誘導(dǎo)細(xì)胞水腫形成中參與