補(bǔ)體在流感病毒-金黃色葡萄球菌共感染致小鼠嚴(yán)重肺炎中的致病機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:近年來(lái)研究表明，感染流感病毒的重癥及死亡病例中有50％～90％與細(xì)菌共感染有關(guān)。目前已報(bào)道能與流感病毒發(fā)生共感染的細(xì)菌有十多種，其中最為常見(jiàn)的有3種，分別是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及肺嗜血桿菌。研究表明，金葡菌與流感病毒共感染的死亡率最高。深入研究共感染過(guò)程中的致病機(jī)制，對(duì)于降低死亡率有重要意義。以往研究表明，在共感染的重癥與死亡病例中常伴有嚴(yán)重的肺部炎癥反應(yīng)。而補(bǔ)體在許多疾病中被證明與炎癥損傷有關(guān)，那么補(bǔ)體是否在流感病毒/

2、細(xì)菌共感染所致炎癥反應(yīng)中也起關(guān)鍵作用？目前這一問(wèn)題尚不清楚，亦未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，選擇以流感病毒和金葡菌構(gòu)建共感染小鼠模型，擬研究補(bǔ)體在共感染過(guò)程中的激活情況及其在致嚴(yán)重肺炎中的作用。
　　目的和意義:從機(jī)體的補(bǔ)體調(diào)節(jié)方面研究流感病毒/金葡菌共感染導(dǎo)致高死亡率的致病機(jī)制，探索補(bǔ)體調(diào)節(jié)作為治療共感染的可能性，為臨床上制定流感病毒/細(xì)菌共感染病例治療方案提供理論依據(jù)，從而最終達(dá)到降低死亡率的目的。
　　研究方法:以亞致死劑量

3、的流感病毒（PR8株）與耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA，簡(jiǎn)稱金葡菌）建立共感染小鼠模型。利用不同的感染時(shí)機(jī)與次序等多種共感染策略，篩選出高死亡率共感染模型。通過(guò)病理切片、ELISA等方法檢測(cè)小鼠肺部炎癥病理反應(yīng)及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，特別是與補(bǔ)體相關(guān)炎性因子C3a與C5a的表達(dá)水平。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)補(bǔ)體C3d蛋白分子在肺組織的沉積水平，檢測(cè)流感病毒與金葡菌在肺臟的分布及病原載量情況。最后利用補(bǔ)體缺陷(C3-/-，C5-/-，MB

4、L-/-)、補(bǔ)體抑制（C3aR-/-，C5aR抗體）及補(bǔ)體耗竭(CVF)等手段建立共感染小鼠模型，觀察肺部炎癥損傷程度與死亡率的變化等情況。
　　結(jié)果:小鼠僅在感染流感病毒0d～3d后感染金葡菌的死亡率最高(＞80％)，而其它共感染組的死亡率均較低，特別是先感染細(xì)菌后感染病毒組的死亡率＜40％。與對(duì)照組相比，高死亡率實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重也呈明顯下降趨勢(shì)。病理組織切片分析結(jié)果表明，d-2組小鼠肺組織損傷面積達(dá)約90％，肺指數(shù)也明顯升高，

5、均明顯高于對(duì)照組;同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞）浸潤(rùn)、肺泡萎縮或?qū)嵸|(zhì)化及鄰近肺泡融合或代償性擴(kuò)張形成較大囊腔的肺大泡。d-2組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ等炎癥相關(guān)因子水平明顯高于對(duì)照組，特別是與補(bǔ)體相關(guān)炎性因子C3a和C5a的表達(dá)量明顯升高。組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，共感染小鼠(d-2組)肺組織有大量的補(bǔ)體C3d蛋白分子沉積，甚至漫延至整個(gè)肺部，明顯多于其它對(duì)照組。補(bǔ)體三條通路的起始因子水平檢測(cè)結(jié)果表明，

6、在共感染組（d-2組）小鼠死亡高峰期，經(jīng)典途徑的起始因子C1q在d-2組小鼠肺部大量沉積，明顯高于對(duì)照組;旁路途徑起始因子CFBa與甘露糖-凝集素途徑起始因子MASP-2在血清中的水平均明顯高于對(duì)照組。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，共感染高死亡率組小鼠血清中補(bǔ)體負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白(CFH、CFI、Crry、CR1、CD59、C4BP、DAF)的含量較對(duì)照組均有明顯下調(diào)，但正性調(diào)節(jié)蛋白(CFP、Nef)下調(diào)無(wú)顯著差異。C3-/-或C5-/-補(bǔ)體缺陷

7、小鼠共感染生存率均為100％，體重恢復(fù)良好且肺部無(wú)明顯損傷情況。過(guò)敏毒素C3a受體缺陷小鼠（C3aR-/-）共感染生存率率上升約50％，甘露糖凝集素缺陷小鼠(MBL-/-)共感染生存率上升約70％。眼鏡蛇毒因子(CVF)耗竭補(bǔ)體結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，治療組生存率上升了近60％，且體重也有顯著地恢復(fù)。過(guò)敏毒素C5a受體抗體(Anti-C5 aR)治療共感染小鼠結(jié)果表明其生存率為70％，明顯高于野生型小鼠對(duì)照組。
　　結(jié)論:成功建立

8、了流感病毒/金葡菌共感染高死亡率小鼠模型，共感染的死亡率與兩種病原的感染次序及感染時(shí)機(jī)明顯相關(guān)，即小鼠僅在先感染流感病毒0d～3d后再感染金葡菌的死亡率最高(＞80％)，明顯高于其它共感染組。高死亡率共感染組小鼠的肺臟均伴有明顯的病理變化和嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，提示嚴(yán)重的肺炎反應(yīng)是造成高死亡率的重要原因之一。高死亡率共感染組小鼠嚴(yán)重肺炎進(jìn)程中伴有補(bǔ)體過(guò)度激活，其中三條補(bǔ)體通路均被激活，提示補(bǔ)體的過(guò)度激活是造成肺部嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的重要原因之一。補(bǔ)

9、體的過(guò)度激活不僅與補(bǔ)體負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白(CFH、CFI、Crry、CR1、CD59、C4BP、DAF)表達(dá)減少有關(guān)，而且兩種病原在小鼠肺部載量的增多與補(bǔ)體激活水平呈正相關(guān)。通過(guò)補(bǔ)體缺陷（C3-/-，C5-/-，MBL-/-）、補(bǔ)體抑制（C3aR-/-，C5aR抗體）及耗竭(CVF)等多種調(diào)節(jié)方式去除補(bǔ)體影響后，均能不同程度減緩共感染小鼠肺部炎癥反應(yīng)、恢復(fù)病理?yè)p傷，且能降低死亡率，表明補(bǔ)體的過(guò)度激活是共感染致嚴(yán)重肺部炎癥反應(yīng)的原因之一。研究結(jié)