砷通過抑制BCAT1基因增加順鉑對(duì)肝癌及肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的殺傷作用.pdf

1、第一部分三氧化二砷通過抑制BCAT1表達(dá)增強(qiáng)順鉑對(duì)肝細(xì)胞癌的殺傷作用及其機(jī)制研究
　　目的:肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上第三大癌癥，大多數(shù)患者需要幾種化療藥物的治療，然而HCC對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，是患者化療失敗的主要原因之一。本研究通過檢測(cè)BCAT1在HCC組織和HCC細(xì)胞株（HepG2和97H）中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討B(tài)CAT1在HCC順鉑(CDDP)耐藥中的作用及其調(diào)控機(jī)制，為ATO聯(lián)合CDDP治療HCC和藥物靶向治療HCC提

2、供新的理論依據(jù)。
　　方法:(1)運(yùn)用western blot法和qRT-PCR法分別檢測(cè)HCC組織和癌旁組織、HCC細(xì)胞株（HepG2和97H）和正常肝細(xì)胞(LO2)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。采用T檢驗(yàn)方法比較組間有無差異。(2) HCC細(xì)胞對(duì)CDDP治療常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，為了驗(yàn)證高表達(dá)的BCAT1是否在HCC的CDDP耐藥中起到作用，首先運(yùn)用小干擾RNA對(duì)HCC細(xì)胞株（HepG2和97H）中的BCAT1進(jìn)行沉默，并用

3、MTT法檢測(cè)BCAT1沉默對(duì)CDDP處理過的HCC細(xì)胞活力的影響。同時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BCAT1沉默對(duì)CDDP處理過的HCC細(xì)胞凋亡的影響。(3) ATO在腫瘤治療中有良好的效果，用western blot法檢測(cè)ATO處理是否可以抑制HCC細(xì)胞中BCAT1的表達(dá)，并檢測(cè)ATO和CDDP聯(lián)合處理后HCC細(xì)胞中BCAT1的蛋白水平。(4)用MTT法檢測(cè)ATO聯(lián)合CDDP處理對(duì)HCC細(xì)胞（HepG2和97H）細(xì)胞活力的影響，同時(shí)檢測(cè)BCAT

4、1過表達(dá)對(duì)ATO聯(lián)合CDDP處理過的HCC細(xì)胞(HepG2和97H)的細(xì)胞活力的影響。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)ATO聯(lián)合CDDP處理對(duì)HCC細(xì)胞凋亡的影響，并檢測(cè)BCAT1過表達(dá)對(duì)ATO聯(lián)合CDDP處理過的HCC細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明HCC組織中BCAT1的mRNA水平顯著高于癌旁組織，western blot法結(jié)果也表明HCC組織中BCAT1蛋白水平顯著高于癌旁組織。然后我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR

5、和蛋白免疫印跡法檢測(cè)HCC細(xì)胞(HepG2和97H)和正常肝細(xì)胞(LO2)中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平。與LO2細(xì)胞相比，HepG2和97H細(xì)胞中BCAT1的mRNA水平和蛋白水平顯著更高。(2) HepG2細(xì)胞用不同濃度的CDDP處理48小時(shí)，BCAT1 siRNA處理的HepG2細(xì)胞對(duì)CDDP表現(xiàn)出更大的敏感性，并且比對(duì)照細(xì)胞具有較低的增殖率和較高的凋亡率。類似地，在97H細(xì)胞中BCAT1的降低可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)CDDP的化學(xué)敏

6、感性，表現(xiàn)為較低的增殖率和較高的凋亡率。(3)我們用2.5、5和10μM的ATO處理HCC細(xì)胞，并通過western blot法測(cè)定48小時(shí)BCAT1的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，ATO以劑量依賴性方式顯著降低HCC細(xì)胞中BCAT1的蛋白表達(dá)。此外，5μM ATO處理以時(shí)間依賴性方式抑制BCAT1表達(dá)。之前已經(jīng)描述了ATO處理降低了c-Myc表達(dá)，c-Myc其是BCAT1基因的反式作用因子。因此，HepG2細(xì)胞用5μM ATO或/和20μM C

7、DDP處理48小時(shí)后，進(jìn)行western blot法測(cè)定c-Myc和BCAT1表達(dá)。結(jié)果顯示5μM的ATO抑制c-Myc和BCAT1表達(dá)。(4)當(dāng)HepG2和97H細(xì)胞用5μM的ATO和20μM CDDP處理48小時(shí)。ATO處理的細(xì)胞顯示出比正常細(xì)胞更低的增殖和較高的凋亡速率。然而，外源性BCAT1過表達(dá)細(xì)胞顯示出比ATO處理的細(xì)胞更高的增殖和較低的凋亡。
　　結(jié)論:(1) HCC組織和HCC細(xì)胞株（HepG2和97H）中BCAT

8、1的mRNA和蛋白水平顯著升高。(2) BCAT1沉默可以導(dǎo)致HCC細(xì)胞對(duì)CDDP更敏感，表明BCAT1表達(dá)降低可以抑制HCC的CDDP耐藥。(3) ATO通過c-Myc來調(diào)節(jié)BCAT1蛋白的表達(dá)降低。(4) ATO處理可以降低HCC細(xì)胞的CDDP耐藥性，并且這種降低可以被BCAT1過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)，提示BCAT1可以在HCC細(xì)胞CDDP耐藥中起到一定作用。
　　第二部分三氧化二砷通過抑制BCAT1表達(dá)增強(qiáng)順鉑對(duì)肝內(nèi)膽管癌的殺傷作用

9、及其機(jī)制研究
　　目的:肝內(nèi)膽管癌（ICC）是發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞肝癌(HCC)的原發(fā)性肝癌，約占原發(fā)性肝癌的10-15％。本研究通過研究ATO聯(lián)合CDDP化療對(duì)ICC細(xì)胞的影響，并探討B(tài)CAT1在ICC耐藥CDDP中的潛在調(diào)控機(jī)制，為ATO聯(lián)合CDDP治療ICC提供一定的臨床參考。
　　方法:(1)為了評(píng)估化療藥物敏感性，我們先用20μM CDDP處理或和5μMATO聯(lián)合處理ICC細(xì)胞（RBE和HUCCT1細(xì)胞）48小時(shí)，然

10、后用MTT法檢測(cè)ATO聯(lián)合CDDP處理對(duì)ICC細(xì)胞活力的影響。(2)為了驗(yàn)證BCAT1表達(dá)是否參與ICC的CDDP耐藥，用western blot法檢測(cè)BCAT1分子和H2AX的表達(dá)，而H2AX分子用來檢測(cè)藥物處理后ICC細(xì)胞的DNA損傷。(3)為了進(jìn)一步驗(yàn)證BCAT1在ATO聯(lián)合CDDP化療中的作用，首先我們通過彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATO聯(lián)合CDDP對(duì)HUCCT1細(xì)胞凋亡的影響，然后運(yùn)用小干擾RNA對(duì)HUCCT1細(xì)胞中的BCAT1進(jìn)行沉默，最

11、后再用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BCAT1沉默對(duì)ATO聯(lián)合CDDP所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:(1)CDDP單獨(dú)處理RBE細(xì)胞時(shí)，RBE細(xì)胞活力未出現(xiàn)顯著的降低;但當(dāng)ATO聯(lián)合CDDP處理RBE細(xì)胞時(shí)，RBE細(xì)胞對(duì)CDDP敏感性增加，細(xì)胞增殖功能發(fā)生障礙，細(xì)胞活力明顯降低。此外，在另一株HUCCT1細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象，ATO聯(lián)合CDDP處理顯著降低HUCCT1的細(xì)胞活力。(2)單獨(dú)CDDP處理RBE細(xì)胞時(shí)對(duì)BCAT1和H2AX的蛋白水

12、平?jīng)]有明顯的影響，統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有意義。然而，ATO聯(lián)合CDDP處理既能明顯誘導(dǎo)H2AX蛋白水平的升高，又能誘導(dǎo)BCAT1蛋白水平的降低。我們又用另一株ICC細(xì)胞株HUCCT1來驗(yàn)證ATO聯(lián)合CDDP的藥物效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和RBE細(xì)胞很相似，ATO處聯(lián)合CDDP處理既能明顯誘導(dǎo)H2AX蛋白水平的升高，又能誘導(dǎo)BCAT1蛋白水平的降低。(3)在彗星實(shí)驗(yàn)中，DNA損傷越嚴(yán)重，彗星的尾部的DNA碎片越多，彗星尾部的面積長(zhǎng)度以及熒光強(qiáng)度就越大，通過測(cè)量

13、這些指標(biāo)可以對(duì)DNA損傷和細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)ATO和單獨(dú)CDDP處理后，HUCCT1細(xì)胞的DNA損傷比對(duì)照組有微弱的增加，但沒有顯著性差異;而ATO聯(lián)合CDDP處理可以誘導(dǎo)HUCCT1細(xì)胞明顯的DNA損傷。接著用小干擾對(duì)BCAT1進(jìn)行沉默，驗(yàn)證BCAT1在ATO聯(lián)合CDDP所誘導(dǎo)的DNA損傷中的作用，結(jié)果顯示BCAT1沉默后，ATO聯(lián)合CDDP處理的ICC細(xì)胞株出現(xiàn)明顯的彗星拖尾現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡增加。
　　結(jié)