耐輻射球菌DR2539 DR2263突變體的構(gòu)建與功能分析.pdf

1、耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的輻射抗性最強的生物之一。研究耐輻射球菌強輻射抗性的機理對于運用該菌進行放射性廢料的處理及腫瘤發(fā)生機制的研究都具有很強的潛在的應(yīng)用價值。目前認(rèn)為它之所以具有這種極端的輻射抗性特征是因為它擁有高效的DNA修復(fù)能力和超強的抗氧化能力。最近有研究顯示，細(xì)胞內(nèi)積累的錳鐵離子比例與其輻射抗性正相關(guān)。耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)也積累了相對較高的錳鐵離子比例，二價錳離子復(fù)合物可能在

2、其抗輻射機制中發(fā)揮了重要作用，二價錳離子可以通過自身發(fā)生氧化還原反應(yīng)來清除輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的羥自由基，減輕了輻射對胞內(nèi)蛋白質(zhì)的攻擊，從而使得參與DNA修復(fù)的各種酶類的活性得以維持，因而其在輻射條件下仍具有高效的DNA修復(fù)能力。目前已經(jīng)在耐輻射球菌中鑒定出兩類錳離子轉(zhuǎn)運蛋白，它們分別是MntH類的DR1709和MntABC類的DR2523、DR2283、DR2284。然而，耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)參與錳離子運輸調(diào)節(jié)和維持其細(xì)胞內(nèi)錳鐵離子平衡的機制還不

3、清楚。研究耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)錳鐵離子平衡的基因，對進一步闡明其輻射抗性機制和探索其潛在的應(yīng)用價值具有非常重要的意義。
　　 DR2539是耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)一種重要的調(diào)控基因，它編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，可能參與錳鐵離子的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)。DR2263編碼一種Dps(DNA protection during starvation)蛋白。 Dps蛋白通過兩種機制來保護DNA不受輻射損傷：(1)Dps蛋白直接與DNA相結(jié)合而保護DNA免受氧自

4、由基的攻擊。(2)Dps與細(xì)胞內(nèi)游離的亞鐵離子結(jié)合，阻止了其與水發(fā)生Feton反應(yīng)，避免產(chǎn)生過多的自由基來保護DNA。因此，Dps蛋白可能在維持細(xì)胞內(nèi)錳鐵離子平衡中起了重要作用。
　　 本研究主要對這兩個基因的功能進行了分析。研究結(jié)果如下：
　　 1：基因DR2539與革蘭氏陽性菌中的dtxR基因類似，主要的生理作用是調(diào)節(jié)鐵離子的吸收；與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的mntR基因也有一定的同源性，參

5、與錳離子運輸?shù)恼{(diào)節(jié)?；駾R2263編碼的Dps含有特定的ferritin(鐵蛋白)結(jié)構(gòu)域，該蛋白為鐵蛋白超家族的成員。
　　 2：用體外三段連接和體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了基因DR2539和基因DR2263的缺失突變體，分別命名為M2539和M2263。通過測定突變株和野生株在不同錳鐵離子濃度的培養(yǎng)基中的生長曲線，發(fā)現(xiàn)M2263和野生株的生長差異不明顯，但是，M2539卻在低錳的培養(yǎng)基中生長明顯減慢。通過測定突變株和野生株對二價

6、錳離子和二價鐵離子的最小抑菌濃度(MIC)發(fā)現(xiàn)，M2263和野生株有著相同的MIC。但是，M2539對二價錳離子的敏感性顯著增強。通過測定突變株和野生株在不同濃度的二價錳、鐵離子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件下細(xì)胞內(nèi)錳鐵離子的含量，發(fā)現(xiàn)M2263的細(xì)胞內(nèi)錳、鐵離子含量與野生株相差不大，但是生長在高濃度二價錳離子培養(yǎng)基中的M2539卻具有很高的細(xì)胞內(nèi)的錳離子含量和錳鐵比例。通過測定突變株和野生株對過氧化氫和甲基紫荊的抗性，發(fā)現(xiàn)M2263和M2539與

7、野生株有著相似的抗性。通過測定突變株和野生株的蛋白酶的水解圈后發(fā)現(xiàn)，M2263和M2539與野生株蛋白酶分泌能力相差不大。
　　 綜上所述，耐輻射球菌基因DR2539可能在調(diào)節(jié)錳離子平衡過程中發(fā)揮了重要作用，DR2539對錳離子的運輸?shù)恼{(diào)節(jié)具有雙重作用，其更多可能類似于mntR?；駾R2263的敲除對耐輻射球菌影響不大，可能其功能被其它基因所替代。鑒于DR2539在調(diào)節(jié)錳離子平衡過程中所發(fā)揮的重要作用，基因DR2539的啟動子