火麻仁提取液對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的干預(yù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、自上世紀(jì)90年代以來(lái)，人口出生率的下降和人均預(yù)期壽命的延長(zhǎng)使中國(guó)人口老齡化的現(xiàn)象日益突出。隨著年齡的增長(zhǎng)，正常老年人客觀上都發(fā)生腦老化，并伴隨有不同程度的記憶力減退。此外，阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)等神經(jīng)退行性疾病引發(fā)的認(rèn)知功能障礙也成為困擾老年人的一大難題。因此，研究認(rèn)知衰老的相關(guān)機(jī)制，探尋延緩腦老化、改善學(xué)習(xí)和記憶障礙的有效干預(yù)措施，對(duì)實(shí)現(xiàn)健康老齡化和提高老年人生活質(zhì)量至關(guān)重要。
　　火麻仁提取液(

2、Extraciton of Fructus Cannabis，EFC)的來(lái)源是火麻仁的干燥成熟果實(shí)，其主要成分是飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)火麻仁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用，在抗氧化、抗炎、抗血栓和降低血脂等方面也有良好的療效。但火麻仁是否對(duì)與老齡相關(guān)的認(rèn)知損害有預(yù)防保護(hù)作用尚不清楚。
　　目的:
　　用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立亞急性衰老大鼠模

3、型，觀察EFC對(duì)D-gal致衰老大鼠在Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，并在mRNA和蛋白水平檢測(cè)與腦老化相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)情況，探討衰老過(guò)程中認(rèn)知減退的分子生物學(xué)機(jī)制;同時(shí)進(jìn)一步在細(xì)胞水平，通過(guò)D-gal誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)的老化，觀察EFC干預(yù)對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。綜上所述，本研究旨在探討EFC對(duì)D-gal致衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶障礙的保護(hù)作用及其機(jī)制。

4、
　　方法:
　　1.將雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組8只，分組方法如下:正常對(duì)照組(control)、D-gal模型組（400mg/kg）、EFC(200mg/kg)預(yù)防組、EFC(400mg/kg)預(yù)防組、D-gal+EFC(200mg/kg)組及D-gal+EFC（400mg/kg）組。以D-gal(400mg/kg)連續(xù)腹腔注射14周的方法建立亞急性衰老模型。D-gal模型組大鼠每日給予腹腔注射D-gal4

5、00mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥14周;正常對(duì)照組給予腹腔注射等量生理鹽水。EFC預(yù)防組于D-gal造模前分別預(yù)防性給予200mg/kg、400 mg/kg EFC連續(xù)灌胃14周，隨后給予D-gal腹腔注射14周。D-gal+EFC組為D-gal造模同時(shí)分別給予EFC200mg/kg、400mg/kg灌胃，連續(xù)14周。此外，正常對(duì)照組與D-gal模型組給予等量生理鹽水的灌胃。
　　2.利用Morris水迷宮評(píng)估D-gal致衰老大

6、鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　3.采用HE染色法觀察D-gal致衰老大鼠海馬錐體神經(jīng)元的病理結(jié)構(gòu)變化。
　　4.WST-1法測(cè)定大鼠腦組織中的總超氧化物歧化酶(super oxidedismutase，SOD)活力及TBA法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平。
　　5.稱重并計(jì)算心臟、肝臟、脾臟和胸腺的臟器系數(shù)。
　　6.應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬齒狀回γ-H2AX及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物G

7、FAP的表達(dá)。
　　7.應(yīng)用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)并比較各組大鼠海馬組織中的APP、Tau、PS1基因的mRNA的表達(dá)差異。
　　8.免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬組織中與腦老化相關(guān)的total Tau，p-Tau、PS1蛋白的表達(dá)水平。
　　9.以D-gal誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞

8、的老化，EFC作為干預(yù)因素，從以下幾方面探討EFC對(duì)D-gal致衰老細(xì)胞的作用:
　　9.1加載DHE熒光探針初步評(píng)估細(xì)胞內(nèi)總ROS生成量后，應(yīng)用FACS流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞內(nèi)總ROS水平。
　　9.2檢測(cè)各處理組細(xì)胞的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(Senescence-associated-β-galactose，SA-β-gal)的活性。
　　9.3免疫熒光法測(cè)定各處理組細(xì)胞的DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX及p-ATM的

9、表達(dá)。
　　9.4免疫印跡法檢測(cè)各處理組細(xì)胞的SIRT1、p53、p21蛋白表達(dá)水平。
　　所得結(jié)果分述如下:
　　第一部分 EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠氧化損傷的保護(hù)作用
　　結(jié)果:
　　1.D-gal模型組與對(duì)照組相比，腦組織SOD活性降低，MDA水平升高(P＜0.05); EFC（400mg/kg）預(yù)防組和D-gal+EFC（400mg/kg）組與D-gal模型組相比，腦組織SOD活性明顯升高而MDA

10、水平顯著下降(P＜0.05)。
　　2.D-gal模型組大鼠的心臟、肝臟、脾及胸腺系數(shù)明顯降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)大鼠與D-gal模型組相比，上述各臟器系數(shù)明顯升高(P＜0.05)。
　　3.大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元HE染色結(jié)果顯示，D-gal模型組與正常對(duì)照組相比，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散、排列稀疏，大部分細(xì)胞胞核出現(xiàn)

11、核固縮，染色加深;D-gal+EFC（400mg/kg）組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元較D-gal模型組排列緊密，出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞數(shù)量明顯減少;EFC(400mg/kg)預(yù)防組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)基本正常，但錐體細(xì)胞層數(shù)較正常對(duì)照組少且細(xì)胞排列稍顯疏松。
　　結(jié)論:
　　1.EFC可通過(guò)提高大鼠抗氧化能力，有效改善D-gal引發(fā)的衰老相關(guān)癥狀。
　　2.EFC可通過(guò)提高脾和胸腺系數(shù)增強(qiáng)大鼠的免疫功能，從而延緩大

12、鼠衰老。
　　3.EFC能減輕D-gal對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元造成的損傷。
　　第二部分 EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用
　　結(jié)果:
　　1.空間定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠在第1天測(cè)試中的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)的距離無(wú)顯著差異。但第2天到第5天測(cè)試結(jié)果顯示，D-gal組大鼠的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)距離與對(duì)照組相比，明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal

13、+EFC（400mg/kg）組大鼠的搜臺(tái)潛伏期和到達(dá)平臺(tái)距離與D-gal組相比，顯著縮短(P＜0.05)。
　　2.定向航行訓(xùn)練第5天，各組大鼠的游泳軌跡顯示，D-gal模型組的游泳軌跡雜亂無(wú)序，運(yùn)動(dòng)軌跡隨機(jī)分布于各個(gè)象限;而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC（400mg/kg）組的游泳軌跡接近正常對(duì)照組，搜索平臺(tái)的策略明顯改善，其運(yùn)動(dòng)軌跡多位于原平臺(tái)位置所在象限或相鄰的象限。
　　3.空間探索測(cè)試中，D-

14、gal模型組大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯減少，在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間也顯著縮短(P＜0.05)。而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠與D-gal模型組相比，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯增加，在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)。
　　4.D-gal模型組大鼠海馬齒狀回GFAP和γ-H2AX陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量，與正常對(duì)照組相比明顯增多(P＜0.05)，而EFC（400mg/kg）預(yù)防組和

15、D-gal+EFC(400mg/kg)組大鼠GFAP和γ-H2AX陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量與D-gal模型組相比則明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.EFC可提高大鼠在Morris水迷宮測(cè)試中的各項(xiàng)成績(jī)，對(duì)D-gal引起的空間學(xué)習(xí)及記憶損傷有一定的改善作用。
　　2.EFC可通過(guò)抑制大鼠海馬齒狀回星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少GFAP的陽(yáng)性表達(dá)來(lái)達(dá)到保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用，從而提高大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　3

16、.EFC可通過(guò)減輕大鼠海馬齒狀回細(xì)胞的DNA損傷，使γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量減少，進(jìn)而改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　第三部分 EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠APP、Tau及PS1基因的影響
　　結(jié)果:
　　qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-gal組海馬組織的APP、Tau、PS1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);與D-gal組相比，EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC(400mg

17、/kg)組大鼠海馬組織中的APP、Tau、PS1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量則顯著下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　EFC可下調(diào)大鼠海馬組織APP、Tau、PS1基因mRNA的表達(dá)，進(jìn)而延緩D-gal致衰老大鼠的神經(jīng)退行性病變，改善認(rèn)知功能。
　　第四部分 EFC對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠Tau，PS1蛋白表達(dá)的影響
　　結(jié)果:
　　免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，D-gal模型組海馬組織Tau蛋白S396位點(diǎn)的磷酸化程

18、度及PS1蛋白的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)，而EFC(400mg/kg)預(yù)防組和D-gal+EFC（400mg/kg）組與D-gal模型組相比，海馬組織Tau蛋白S396位點(diǎn)的磷酸化程度與PS1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。但各組間總Tau蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。
　　結(jié)論:
　　EFC可能通過(guò)下調(diào)Tau蛋白磷酸化程度及PS1蛋白的表達(dá)水平，以此發(fā)揮延緩腦老化的作用，改善D-gal所致的空間學(xué)

19、習(xí)和記憶障礙。
　　第五部分 EFC對(duì)SIRT1表達(dá)及p53-p21途徑的影響及其機(jī)制
　　結(jié)果:
　　1.ROS熒光探針(DHE)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-gal(400mM)處理組細(xì)胞產(chǎn)生的ROS熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，EFC（50μg/ml）預(yù)處理24h后，ROS熒光信號(hào)明顯減弱。FACS流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)結(jié)果表明，D-gal處理組細(xì)胞ROS生成百分比最高達(dá)45.2％，對(duì)照組為1.4％，D-gal+EFC組及EF

20、C組分別為3.2％和2.5％。
　　2.D-gal處理組的衰老細(xì)胞明顯增多，40％的3T3細(xì)胞SA-β-gal染色陽(yáng)性;而D-gal+EFC組及EFC組與D-gal處理組相比，SA-β-gal染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　3.免疫熒光染色結(jié)果顯示，D-gal(400mM)處理后細(xì)胞的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量增加、p-ATM顯色加強(qiáng)，而用EFC（50ug/ml）預(yù)處理細(xì)胞24h后，D-gal+EFC組及EFC預(yù)防組γ-H2AX

21、焦點(diǎn)數(shù)量減少、p-ATM顯色明顯減弱。
　　4.免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-gal處理組NIH/3T3細(xì)胞的SIRT1表達(dá)水平降低，p53、p21表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而EFC預(yù)處理細(xì)胞24h后，D-gal+EFC組及EFC組的SIRT1表達(dá)上調(diào)，p53、p21表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.EFC可能通過(guò)提高NIH/3T3細(xì)胞的抗氧化能力而抑制ROS的生成，進(jìn)而延緩細(xì)胞