胃癌變相關(guān)分子事件研究SMC4在肺腺癌中的功能及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
　　第一部分 胃癌變相關(guān)分子事件研究
　　第一章 胃癌前病變及胃癌全基因組表達(dá)譜研究
　　背景:胃癌變是一個(gè)多階段、多因素、多基因參與的復(fù)雜過程。胃多階段癌變模型認(rèn)為正常胃粘膜進(jìn)展為胃癌需要以下幾個(gè)連續(xù)階段:正常胃粘膜→非萎縮性胃炎→多灶萎縮性胃炎→腸化生→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→癌。利用表達(dá)譜芯片技術(shù)全面系統(tǒng)的對(duì)胃癌前病變及胃癌序列進(jìn)行分子生物學(xué)研究，具有重要的臨床和科研

2、價(jià)值。
　　目的:本課題旨在研究胃癌變各階段組織在分子表達(dá)譜水平上的相似性和差異性;篩選胃癌變過程中可能起關(guān)鍵作用的分子，挖掘胃癌早期診斷標(biāo)志物。
　　方法:本部分研究收集了66對(duì)胃不同病變階段新鮮組織，包括20例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、23例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、19例早期胃癌、4例進(jìn)展期胃癌和配對(duì)的鄰近染色正常組織，用于全基因組表達(dá)譜芯片的檢測(cè);收集了50例胃癌患者的福爾馬林浸泡石蠟包埋組織樣本，一張切片上同時(shí)包括正常組織、癌前病

3、變組織和胃癌組織，利用免疫組織化學(xué)染色(immunochemistry，IHC)對(duì)表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)篩選出的分子進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:胃癌前病變及胃癌樣本表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在分子水平上胃癌前病變與胃癌具有相似性:很多腫瘤細(xì)胞的特征，例如DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等相關(guān)基因的上調(diào)以及生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控、支鏈氨基酸代謝等相關(guān)基因的下調(diào)，在癌前病變階段已經(jīng)顯現(xiàn);癌前病變組織和胃癌組織相對(duì)于鄰近組織有著相似的差異表達(dá)模式，在胃癌組織中差異表

4、達(dá)的基因絕大多在癌前病變階段已經(jīng)有了一致的差異表達(dá)。此外，胃癌前病變和胃癌在分子表達(dá)譜上存在差異性，主要涉及免疫反應(yīng)和細(xì)胞粘附。一方面，我們發(fā)現(xiàn)562個(gè)基因可能參與了胃癌變過程，其中在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中最為核心且緊密聯(lián)系的8-基因模塊為CD40LG、CTLA4、GZMB、ICAM1、ITGAX、SELL、TGFB1、TNF，這些分子參與了淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移、免疫負(fù)調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)組織等過程，與胃癌患者的總生存相關(guān)。另一方面，為了尋找胃

5、癌早期診斷標(biāo)志物，我們挑選了4個(gè)在胃癌變過程中表達(dá)水平持續(xù)升高的基因進(jìn)行后續(xù)免疫組化驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在胃癌變過程中，CCL3和CD300A的蛋白表達(dá)量和陽性率持續(xù)升高;與鄰近組織相比，OSM和CHI3L1在癌前病變組織和胃癌組織中的表達(dá)量和陽性率顯著升高，然而OSM和CHI3L1在癌前病變組織和胃癌組織中的表達(dá)量和陽性率沒有顯著差異。受試者工作特征曲線分析結(jié)果表明這四個(gè)分子對(duì)胃癌早期診斷可能具有一定的臨床價(jià)值。
　　結(jié)論:在分子水

6、平上胃癌前病變與胃癌具有相似性，胃癌前病變可能是胃癌發(fā)生的基礎(chǔ)。胃癌前病變和胃癌在分子表達(dá)譜上存在差異性，主要涉及免疫反應(yīng)和細(xì)胞粘附，這些基因的變化可能與癌前病變向胃癌惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。8-基因模塊可能在胃癌變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CCL3，CD300A，CHI3L1和OSM是潛在的胃癌早期診斷標(biāo)志物。以胃多階段癌變模型作為理論基礎(chǔ)，利用胃不同病變階段樣本對(duì)胃癌變過程進(jìn)行研究，有助于闡明胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找癌變關(guān)鍵分子和潛在的胃癌早期診斷標(biāo)

7、志物。
　　第二章 胃癌前病變及胃癌TCR免疫組庫研究
　　背景:基于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫治療，主要依賴于抗原和T細(xì)胞受體(T-cellreceptor, TCR)的相互作用，已經(jīng)在實(shí)體瘤的治療中顯現(xiàn)出潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，TCR免疫組庫的很多基本特征仍然不清楚;癌變過程中TCR免疫組庫的變化，尤其是癌前病變階段，目前還沒有任何相關(guān)研究。
　　目的:本課題旨在探究胃癌變過程中組織浸潤(rùn)TCR免疫組庫的特征以及病變組

8、織分子表型與病變微環(huán)境TCR免疫組庫的關(guān)系。
　　方法:研究納入了41例不同病變階段的胃組織樣本，包括低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期胃癌和配對(duì)的鄰近組織。我們通過多重PCR捕獲建庫和Ilumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)TCRβ互補(bǔ)決定區(qū)3進(jìn)行了深度測(cè)序。此外，為了研究病變組織分子表型與病變微環(huán)境TCR免疫組庫的關(guān)系，我們對(duì)相應(yīng)的胃癌前病變樣本和早期胃癌樣本進(jìn)行了全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)。
　　結(jié)果:分析結(jié)果顯

9、示，T細(xì)胞克隆多樣性和TCR免疫組庫的頻率分布在胃癌變過程中沒有顯著變化。然而，在胃癌變過程中，病變組織和配對(duì)鄰近組織TCR免疫組庫的相似性逐漸降低。病變組織和配對(duì)鄰近組織之間的TCR免疫組庫的重疊逐漸降低，為抗原驅(qū)動(dòng)克隆擴(kuò)增提供了直接的證據(jù);越來越多的病變抗原相關(guān)T細(xì)胞克隆變成了高頻克隆，而且它們占有的頻率在胃癌變過程中逐漸增加。此外，病變組織和配對(duì)鄰近組織之間的共有高頻T細(xì)胞克隆的頻率相似性在胃癌變不同階段迅速降低。最后，利用基于網(wǎng)

10、絡(luò)的派系過濾方法對(duì)表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和TCR免疫組庫變異指數(shù)進(jìn)行整合分析，我們找到了一個(gè)包含11個(gè)基因的模塊，這11個(gè)基因的表達(dá)量與胃癌病人的總生存顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:我們的研究闡明了在胃癌變過程中組織浸潤(rùn)TCR免疫組庫的多階段異質(zhì)性。突變細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用可能在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。本研究加深了我們對(duì)胃癌變過程中免疫反應(yīng)的理解。
　　第二部分 SMC4在肺腺癌中的功能及相關(guān)分子機(jī)制研究
　　背景:越

11、來越多的證據(jù)顯示，胚胎發(fā)育和腫瘤形成在組織形態(tài)、細(xì)胞生物學(xué)學(xué)行為以及分子表達(dá)模式等方面具有極大的相似性。利用胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生的相似性，重新審視正常發(fā)育的獨(dú)特過程，深入挖掘胚胎發(fā)育過程中分子譜的變化規(guī)律，可以在最大程度上規(guī)避腫瘤異質(zhì)性給研究帶來的種種困難。染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(Structural maintenance of chromosome4，SMC4)是集縮素蛋白復(fù)合體(condensin)的核心蛋白，主要參與染色體的凝集和分

12、離。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的人胚胎肺發(fā)育樣本和肺腺癌樣本mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，SMC4在胚胎肺發(fā)育過程中持續(xù)下調(diào)，在肺腺癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá)。
　　目的:本課題旨在探索從肺發(fā)育數(shù)據(jù)中挖掘的蛋白SMC4在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的功能及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:首先，利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)對(duì)43對(duì)手術(shù)切除的肺腺癌組織及其癌旁組織的SMC4 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。接著，利用IHC對(duì)75例FFPE肺腺癌組

13、織及其癌旁組織的SMC4蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，并利用log-rank檢驗(yàn)分析了SMC4表達(dá)量與肺腺癌病人生存的關(guān)系。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMC4對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。為了進(jìn)一步探索SMC4在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，我們通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析找到了SMC4潛在的相互作用蛋白DDX46(DEAD-box helicase46)。最后，利用免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SMC4和DDX46的相互作用

14、。
　　結(jié)果:Real-time PCR和IHC分別從RNA和蛋白水平上證實(shí)了SMC4在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，而且SMC4蛋白高表達(dá)是肺腺癌獨(dú)立的預(yù)后不良因素（log-rank檢驗(yàn)，p=0.036）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，SMC4敲降顯著抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲。此外，SMC4敲降后，與增殖相關(guān)的蛋白PLK1，Cyclin B1，CDK1表達(dá)量顯著下調(diào)。對(duì)人胚胎肺發(fā)育樣本和肺腺癌樣本mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SM

15、C4和DDX46表達(dá)模式相似;Speraman相關(guān)性分析結(jié)果表明，SMC4和DDX46的mRNA表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.629，p＜0.0001)。正反向Co-IP證實(shí)SMC4和DDX46存在相互作用。免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SMC4和DDX46在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相均存在共定位現(xiàn)象。
　　結(jié)論:SMC4在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁肺組織，而且SMC4蛋白高表達(dá)是肺腺癌獨(dú)立的預(yù)后不良因素。SMC4促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲