非共平面多氯聯(lián)苯的致突變作用——人類CYP2E1為主要活化酶.pdf

1、多氯聯(lián)苯(PCBs)是一組持久性有機污染物，在2013年已被國際癌癥研究組織(IARC)確認(rèn)為第一類致癌物。盡管30多年前許多國家已經(jīng)禁止PCBs的生產(chǎn)和銷售，但因其化學(xué)穩(wěn)定性和食物鏈富集作用而仍然存在于環(huán)境中。PCBs作為全球性污染物對人體健康構(gòu)成危害，可引起內(nèi)分泌紊亂、癌前病變、癌變、肝臟、生殖及免疫功能損害、生長發(fā)育障礙等，因此對PCBs毒性的研究很有必要。PCBs可分為共平面[二噁英類似，dioxin-like(DL)]和非共平

2、面[非二噁英類似，non-dioxin-like(NDL)化合物，DL-PCBs可持續(xù)激活芳烴受體(AHR)，從而引起各種病理變化[包括致癌作用和細(xì)胞色素P450第一家族(CYP1)酶蛋白誘導(dǎo)等];而NDL-PCBs則可被CYP2E1代謝活化為致突變物。DL-PCBs共包括12個化合物（例如PCB77、PCB81等）;在數(shù)目更多的NDL-PCBs中，最受關(guān)注的是人體負(fù)荷較高的7個指示性PCBs（例如PCB52、PCB28、PCB20等）

3、。關(guān)于PCBs的致突變性（致癌作用的一個主要機制），目前認(rèn)為主要涉及NDL-PCBs。最近發(fā)現(xiàn)人CYP2E1可活化多個二氯聯(lián)苯化合物為致突變物;近期的試驗結(jié)果提示三氯聯(lián)苯化合物中PCB22的CYP2E1依賴性致突變作用強于所有12個二氯聯(lián)苯。因此本研究主要采用NDL-PCBs中的PCB22和PCB52（后者為指示性PCBs之一），觀察其誘發(fā)哺乳動物細(xì)胞微核與基因突變作用，并探討人CYP2E1、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、C

4、YP3A4對其代謝活化的貢獻大小。
　　目的:
　　1.驗證重組表達不同生物轉(zhuǎn)化酶的V79衍生細(xì)胞系中人CYP1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1酶的表達及其特征性代謝活化作用[V79-Mz細(xì)胞不具有CYPs、UDP-glucuronosyl transferases(UGTs)或sulfotransferases(SULTs)]。
　　2.觀察細(xì)胞內(nèi)人CYP酶(1A1、1B1、1A2、3A4

5、、2E1)對PCB22和PCB52的代謝活化和相關(guān)致突變作用;比較不同CYP亞型對受試PCBs活化作用的差異。
　　3.對一系列NDL-PCBs化合物（包括本團隊已報道的二氯聯(lián)苯化合物以及此次研究的三氯和四氯聯(lián)苯化合物PCB20、PCB22、PCB52）CYP2E1依賴性致突變強度排序，并分析其結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系，以期為PCBs健康危險度評價提供參考。
　　方法:
　　1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡(Wester

6、n Blot)試驗
　　采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡(Western Blot)對重組V79衍生細(xì)胞所表達的酶蛋白進行鑒定（表達hCYP1A1、hCYP1B1、hCYP1A2、hCYP3A4、和hCYP2E1的細(xì)胞以及V79-Mz對照細(xì)胞）。
　　2.CCK-8試驗
　　系列濃度的PCB22、PCB52、甲磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)、N-二甲基亞硝胺(N-Nitroso

7、dimethylamine，NDMA)、2-硝基丙烷(2-nitropropane，2-NP)、苯丙(a)芘(Benzo(a)pyrene，B(a)P)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)對V79-Mz和表達不同代謝酶的V79衍生細(xì)胞進行染毒。作為溶劑DMS0終濃度＜2‰(v∶v)，每組設(shè)置6個重復(fù)樣，染毒/恢復(fù)時程為12h/12h（對應(yīng)于微核試驗）或24h/48h（對應(yīng)于致突變試驗），按CCK-8試驗標(biāo)準(zhǔn)程序操作，最

8、后測定樣品在450nm處光密度值。以細(xì)胞相對生長/存活率不低于60％為微核試驗受試物濃度選擇的原則。
　　3.微核試驗
　　微核試驗是檢測染色體或者有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性實驗方法。分別采用上述六個細(xì)胞系進行PCB22和PCB52（以及作為參照化合物的各CYP酶依賴性前致突變物）的微核實驗，以及用V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞進行PCB20的微核實驗。采用12h/12h染毒/恢復(fù)時程，然后經(jīng)消化、低滲、固定

9、、滴片、染色步驟，最后在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察并記錄隨機出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)完整（無凋亡或壞死）細(xì)胞中含微核的細(xì)胞頻率。每個樣品共觀察2000個細(xì)胞，并計算各組微核細(xì)胞率（均數(shù)±變異范圍，n=2）。
　　4.Hprt致突變試驗
　　細(xì)胞在Hprt（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）位點的正向突變（即獲得對6-巰基嘌呤的抗性）為觀察終點。細(xì)胞接種24h后染毒1d，于4d和7d分別傳代。第二次傳代時接種細(xì)胞分別測試細(xì)胞在正常培養(yǎng)液中的集落形成率

10、(n=3)和對6-巰基嘌呤有抗性的突變子(n=4)頻率。7-10天后計算集落形成率和突變細(xì)胞率。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　CCK-8的實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用AVOVA;Hprt致突變試驗和微核實驗結(jié)果以均數(shù)±變異范圍表示，但在統(tǒng)計學(xué)處理前將重復(fù)測定值合并以轉(zhuǎn)化為計數(shù)資料，分別采用Fisher確切概率法和卡方檢驗分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫印跡實驗未顯示V79-Mz細(xì)胞表達任何CYP酶，

11、而V79-hCYP1A1、V79-hCYP1B1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR、V79-CYP2E1-SULT1A1分另表達CYP酶1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1。
　　2.以CCK-8試驗觀察EMS（直接致突變物）、NDMA、2-NP、B(a)P、AFB1（前致突變物）與PCB22和PCB52分別作用于V79-Mz和各相應(yīng)V79衍生細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用。各前致突變物對表達相

12、應(yīng)活化酶的細(xì)胞和V79-Mz對照細(xì)胞的作用未見明顯差異。依據(jù)所獲結(jié)果，選擇細(xì)胞相對生長/存活水平不低于60％作為微核試驗和Hprt致突變試驗濃度設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn)，即EMS:5mM;NDMA:100μM,300μM;2-NP:2mM,4mM;B(a)P:2μM，4μM，8μM;AFB1:0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM。
　　3.作為陽性對照EMS誘發(fā)V79-Mz細(xì)胞產(chǎn)生微核與基因突變，但前致突變物NDMA、2

13、-NP、B(a)P和AFB1對V79-Mz均無明顯作用。然而，NDMA和2-NP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞基因突變，且呈濃度依賴性;B(a)P誘發(fā)V79-hCYP1A1與V79-hCYP1B1細(xì)胞基因突變和微核形成，均有明顯濃度-效應(yīng)關(guān)系;AFB1則對V79-hCYP1A2和V79-hCYP3A4-hOR細(xì)胞均誘發(fā)基因突變和微核形成，并顯示濃度相關(guān)性。
　　4.PCB22(2μM～6μM)、PCB52(10μ

14、M～40μM)和PCB20(1μM～4μM)誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞微核形成，且效應(yīng)呈現(xiàn)濃度依賴性;而在表達其它CYPs的V79衍生細(xì)胞僅在最高受試濃度(40μM)呈現(xiàn)出具有統(tǒng)計學(xué)意義的微核細(xì)胞率（輕度）增高，或者未出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。受試PCBs及各參照化合物對V79-Mz細(xì)胞微核試驗結(jié)果均為陰性。
　　5.PCB22、PCB52對V79-Mz細(xì)胞無致突變作用，而對V79-CYP2E1-SULT1A1細(xì)胞具有

15、很強的致突變作用，并呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。二受試物在最高受試濃度均對V79-hCYP1B1細(xì)胞誘發(fā)輕度基因突變，在其余細(xì)胞系（V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR）則未出現(xiàn)致突變作用。而PCB20對V79-Mz細(xì)胞無致突變作用，對V79-CYP2E1-SULT1A1細(xì)胞具有很強的致突變作用，并呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1.重組V79衍生細(xì)胞系V79-hCYP1A1、V79-hC

16、YP1B1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR、V79-CYP2E1-SULT1A1分另表達人類CYP1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1;前致突變物B(a)P、AFB1、NDMA、2-NP誘發(fā)相應(yīng)微核與基因突變，而對V79-Mz無作用，說明細(xì)胞內(nèi)所表達的重組酶蛋白具有相應(yīng)的代謝活化作用。
　　2.PCB22和PCB52對表達五種人CYP酶（CYP1A1、1B1、1A2、3A4和共同表