草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）CYP2E1誘導(dǎo)體外模型研究.pdf

1、CYP2E1屬于藥物代謝酶P450家族，主要參與小分子量外來(lái)化學(xué)物的代謝活化，包括大量的強(qiáng)親電子物和前致癌物，在環(huán)境污染檢測(cè)中有重要應(yīng)用。本文制備草魚(yú)肝微粒體和原代肝細(xì)胞，研究了草魚(yú)肝微粒體、原代肝細(xì)胞和肝細(xì)胞系中CYP2E1的活性狀況；以乙醇為誘導(dǎo)劑研究了不同體系對(duì)乙醇誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，并對(duì)劑量效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合。 CYP酶代謝是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要途徑，其數(shù)量和活性大小直接影響藥物在體內(nèi)的活化與代謝。本文對(duì)草魚(yú)肝微粒體C

2、YP酶含量及其活性進(jìn)行了初步研究，以差速離心法提取草魚(yú)肝微粒體，以CO還原差示光譜法測(cè)得CYP酶及細(xì)胞色素b5含量分別為0.619±0.102 nmol/mg，0.264±0.042 nmol/mg。以7-乙氧異吩噁唑酮-O-脫乙基反應(yīng)、苯胺-4-羥化反應(yīng)、氨基比林-N-脫甲基反應(yīng)作為CYP1A、CYP2E、CYP3A的探針?lè)磻?yīng)，測(cè)得CYPIA酶活為O.043±0.004 nmol/mg/min,CYP2E1酶活為0.028±0.002

3、 nmol/mg/min，CYP3A酶活為0.207±0.035 nmol/mg/min。結(jié)果表明草魚(yú)肝微粒體中CYP酶發(fā)育完好，并且具有參與藥物代謝的3種主要亞型活性，其含量與活性大小與其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相差較大。本實(shí)驗(yàn)的方法與結(jié)果為草魚(yú)CYP酶的系統(tǒng)研究提供可靠手段，最終為指導(dǎo)水產(chǎn)合理用藥提供理論依據(jù)。 原代肝細(xì)胞基本維持了肝臟的代謝功能，特別是很好的保留了與體內(nèi)一致的細(xì)胞色素P450酶的水平，是體外藥物試驗(yàn)的理想模型和分析手段。

4、以消化法制備草魚(yú)原代肝細(xì)胞，在6h內(nèi)新鮮分離的肝細(xì)胞CYP2E1活性為(0.031±0.003)(nmol/min·mg)，與體內(nèi)情況一致。原代細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受能力較弱，乙醇濃度10～40mmol/L，LDH的滲出量與乙醇濃度呈正相關(guān)，乙醇濃度為80～160 mmol/L，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的死亡脫落。原代肝細(xì)胞暴露于10mmol/L的乙醇0～24h，CYP2E1活性和LDH滲出量均呈上升趨勢(shì)，表明10mmol/L乙醇依然會(huì)對(duì)原代肝細(xì)胞造成一

5、定的損傷。 以乙醇為細(xì)胞色素P450 2E1的誘導(dǎo)劑，在草魚(yú)肝細(xì)胞L8824、GCL細(xì)胞中研究了該誘導(dǎo)劑與酶活性之間的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系和劑量效應(yīng)關(guān)系，試驗(yàn)以CHSE-1細(xì)胞為對(duì)照。細(xì)胞傳代后培養(yǎng)48h，加入含有不同濃度乙醇的新鮮培養(yǎng)基，孵育誘導(dǎo)24h，加入底物苯胺反應(yīng)30min。以苯胺的代謝產(chǎn)物4-氨基酚的生成量來(lái)反映CYP2E1活性。CHSE-1細(xì)胞試驗(yàn)表明苯胺濃度為10～16mmol/L時(shí)CYP2E1活性最大，可達(dá)(0.152±

6、0.095)nmol/min·mg，該濃度范圍的苯胺適合用于指示CYP2E1的活性。以Gentox模型對(duì)誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)進(jìn)行擬合，得到三個(gè)先升高后降低的曲線，說(shuō)明乙醇對(duì)CHSE-1、L8824和GCL細(xì)胞中CYP2E1有先誘導(dǎo)后抑制作用。擬合方程為F(x)=(PO+kx)/(1+(x/EC<,50>)<'nH>)參數(shù)P<,0>分別為0.140，0.275，0.142；nH分別為2.456，2.319，2.106；k分別為為0.024，0.