鉤吻生物堿的P450酶代謝及其毒性相關(guān)性研究.pdf

1、中藥鉤吻（Gelsemium elegans）是馬錢科(Loganiaceae)植物胡蔓藤的全草，中醫(yī)用于治療風(fēng)濕痹痛和神經(jīng)痛等。近年來鉤吻因其鎮(zhèn)痛效能僅次于嗎啡且無成癮性，成為了研究的熱點(diǎn)。然而，鉤吻在臨床應(yīng)用中常發(fā)生中毒事件，吲哚型生物堿既是其活性成分，又是毒性成分。因此，如何減毒是鉤吻安全應(yīng)用需解決的關(guān)鍵問題。細(xì)胞色素P450酶（CYP酶）對藥物的減毒有重要作用，介導(dǎo)著許多有毒中藥的減毒機(jī)制。
　　基于此，本論文以鉤吻中的3

2、個毒效成分(鉤吻素子(KOU)、鉤吻素甲(GA)及胡蔓藤堿甲(HMT))為研究對象，主要進(jìn)行了鉤吻生物堿的CYP酶代謝及其毒性相關(guān)性研究，旨在為揭示鉤吻減毒的科學(xué)內(nèi)涵，提高藥物療效和安全性提供參考依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下所述:
　　一、鉤吻生物堿的CYP酶代謝機(jī)理研究
　　在體外肝微粒體作用下，KOU、GA、HMT分別至少生成4、5、4個代謝產(chǎn)物，其代謝途徑相似，包括去甲基、脫氫、羥基化、去甲基脫氫與氧化?；瘜W(xué)抑制劑及人源化重

3、組CYP酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，參與三個單體代謝的主要CYP酶亞型均為CYP3A4/5。通過小鼠腹腔注射地塞米松或酮康唑，動物體內(nèi)的CYP3A4/5活性能被相應(yīng)地誘導(dǎo)或抑制。鉤吻生物堿在CYP3A4/5活性被誘導(dǎo)的微粒體中的代謝均顯著升高，而在CYP3A4/5活性被抑制的微粒體中，其代謝率均顯著降低（P＜0.05），這進(jìn)一步從體內(nèi)證明了鉤吻生物堿的主要代謝酶是CYP3A4/5。
　　為了研究不同動物種屬（人、大鼠、小鼠）的肝微粒體代謝酶

4、對GA代謝的影響，分別考察了2.5-640μM的GA在這三種動物肝微粒體中的代謝速率。首先通過大鼠灌胃給藥GA，收集尿液糞便，處理分離純化得到其主要代謝產(chǎn)物，經(jīng)核磁共振鑒定為4-N-去甲基GA。用4-N-去甲基GA的含量變化表示GA在肝微粒體中的代謝速率，結(jié)果表明，GA在三種動物肝微粒體中的代謝均符合經(jīng)典米式方程，代謝速率快慢依次為:人肝微粒體(705.6±36.2pmol/mg/min)＞小鼠肝微粒體(632.1±16.0pmol/m

5、g/min)＞大鼠肝微粒體(229.1±15.9pmol/mg/min)。這表明GA的體外代謝有顯著性種屬差異。
　　為了考察HMT在大鼠體內(nèi)的處置特征，本研究建立了靈敏的UPLC-MS/MS檢測方法，并計(jì)算了HMT在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。HMT在大鼠體內(nèi)吸收迅速，口服給藥HMT12.50±2.74min后，其血藥濃度達(dá)到峰值(Cmax28.49±6.65nmol/L)，消除半衰期（T1/2）為82.22±35.55min。推

6、測其血藥濃度的迅速降低與藥物代謝酶的代謝作用密切相關(guān)。
　　二、鉤吻生物堿的CYP酶代謝與其毒性相關(guān)性研究
　　首先，采用MTT法測定了鉤吻生物堿對L-02人正常肝細(xì)胞的增殖毒性，結(jié)果表明，KOU和GA在較高濃度（600-800μM）時對L-02細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用(P＜0.001)。而HMT對L-02細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.001）。
　　其次，給小鼠腹腔注射酮康唑(KET)，形

7、成體內(nèi)CYP3A4/5活性抑制的模型。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予腹腔注射KET四天后，再灌胃給予鉤吻生物堿;對照組小鼠直接灌胃給予相同劑量的鉤吻生物堿。結(jié)果表明，對照組小鼠并未出現(xiàn)死亡;而實(shí)驗(yàn)組小鼠在14天內(nèi)的生存率降低至0％(GA)和20％以下(HMT)。這表明抑制CYP3A4/5活性，鉤吻生物堿的毒性顯著增加。
　　最后，為了進(jìn)一步考察CYP酶代謝對GA毒性的作用，分別給予斑馬魚相同濃度的GA及代謝物4-N-去甲基GA。結(jié)果顯示，GA的濃

8、度為750μM時，斑馬魚有部分死亡，出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng);而相同濃度下，代謝物4-N-去甲基GA對斑馬魚則無毒性反應(yīng)。經(jīng)計(jì)算，GA及代謝物對斑馬魚的半數(shù)致死濃度分別為0.81和7.42mg/mL。該結(jié)果表明經(jīng)CYP酶代謝后，GA轉(zhuǎn)化成為毒性更小的代謝物。
　　綜上所述，本研究首次證明鉤吻生物堿在人、鼠肝微粒中的代謝途徑主要為去甲基、脫氫、羥基化、去甲基脫氫和氧化反應(yīng)，且參與其最主要的代謝酶亞型為CYP3A4/5。同時證明鉤吻生物堿經(jīng)