子宮頸鱗狀細胞癌中p16異常表達的分子病理機制研究.pdf

1、子宮頸癌是女性最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第二位，我國是子宮頸癌高發(fā)區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染是子宮頸癌發(fā)生的必要條件，HPV陽性子宮頸上皮內瘤變及鱗狀細胞癌p16表達較正常宮頸上皮明顯升高，但其異常表達的分子機制及意義不明，本課題分別以HPV16陽性的子宮頸鱗癌Caski及HPV陰性的高分化宮頸鱗癌HCC94細胞為研究對象，對子宮頸鱗癌p16表達升高的分子機制進行了初步研究。
　　首先設計HPV

2、16E6/E7特異性引物，RT-PCR擴增E6/E7基因，構建E6/E7基因過表達質粒pcDNA3.1-HPV16E67。采用脂質體法將HPV16E6/E7基因過表達質粒及對照空質粒分別轉染至HCC94細胞，實時熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測兩組HCC94細胞中E6/E7及p16ink4a基因mRNA和蛋白表達水平。設計合成E6/E7基因特異性shRNA干擾質粒，將干擾質粒及空質粒載體經(jīng)脂質體介導分別轉染至

3、caski細胞中，實時熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測兩組caski細胞中E6/E7基因沉默效率及p16ink4a基因mRNA和蛋白表達水平。實驗結果顯示，在過表達E6/E7的HCC94細胞中，E6/E7及p16ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表達量均有明顯上升;在沉默E6/E7的caski細胞中，E6/E7及p16ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表達量均有明顯下降。
　　進一步探究E6、E7基

4、因單獨過表達與沉默對p16ink4a基因表達水平的影響，我們構建了E7過表達質粒，E6過表達質粒及E6、E7干擾RNA（由天一輝遠公司幫助合成）。分別將E6、E7過表達質粒和空質粒載體經(jīng)脂質體介導轉染至HCC94細胞中，實時熒光定量PCR法分別檢測三組HCC94細胞中E6、E7及p16ink4a基因mRNA表達水平，Western blotting法分別檢測三組HCC94細胞中E6、E7及p16ink4a蛋白表達水平。分別將E6、E7特

5、異性siRNA及負對照RNA轉染至caski細胞中，實時熒光定量PCR法分別檢測三組caski細胞中E6、E7及p16ink4a基因mRNA表達水平，Western blotting法分別檢測三組caski細胞中E6、E7及p16ink4a蛋白表達水平。實驗結果顯示對照組及單獨過表達與沉默E6基因組并未引起p16ink4a基因在HCC94和caski細胞中表達量的改變;單獨過表達及沉默E7基因組則引起了p16ink4a基因在HCC94細

6、胞中表達的上升及在caski細胞中表達的下降。
　　為了進一步研究p16ink4a基因對子宮頸鱗癌細胞系周期相關基因cyclinD1與增殖相關基因Ki67的調控，及p16ink4a基因對細胞生長曲線的影響，我們構建了p16ink4a基因的過表達質粒及干擾RNA。采用脂質體法將p16ink4a基因過表達質粒及空質粒分別轉染至子宮頸鱗癌細胞系HCC94中，實時熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測兩組HCC94細

7、胞中p16ink4a、cyclinD1及Ki67基因mRNA和蛋白表達水平，MTT法檢測兩組HCC94細胞增殖能力變化。將p16-siRNA及負對照siRNA經(jīng)脂質體介導分別轉染至子宮頸鱗癌細胞系caski中，實時熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測兩組caski細胞中p16ink4a基因沉默效率及cyclinD1、Ki67基因mRNA和蛋白表達水平，MTT法檢測兩組caski細胞增殖能力變化。實驗結果表明過表達

8、p16ink4a基因可引起cyclinD1、Ki67表達水平的升高，細胞生長曲線呈上升趨勢，沉默p16ink4a基因可引起cyclinD1、Ki67表達水平的降低，細胞生長曲線呈下降趨勢。在子宮頸鱗狀細胞癌中p16ink4a基因表達水平與cyclinD1及Ki67基因具有正相關性，過表達p16ink4a促進子宮頸鱗癌細胞增殖。
　　在本課題中我們進一步研究并闡明HPV相關性子宮頸上皮內瘤變及鱗狀細胞癌中p16ink4a基因的異常表