p16、p53及hTERC在HPV檢測陰性子宮頸鱗癌中的表達.pdf

1、宮頸癌是全球女性中第二最常見的惡性腫瘤，占所有癌癥的9.8％。全球每年約有500000宮頸癌新發(fā)病例，其中一半的人死于宮頸癌，而80%的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。HPV感染一直以來被認為是宮頸癌形成的主要致病因素，其中起關(guān)鍵作用的是致癌基因 E6、E7。然而，許多研究顯示存在約10%的子宮頸腺癌和一定比例的子宮頸鱗癌HPV檢測為陰性。
　　p53作為一個腫瘤抑制因子，它是控制細胞增殖的最主要因子之一。HPV E6致癌蛋白通過E6 AP

2、與p53結(jié)合形成復合物，導致p53的下調(diào)；在正常的細胞中，p16是一個增殖的負性調(diào)節(jié)因子，它通過一個負性反饋環(huán)一旦Rb基因產(chǎn)物失活就使 CDK4下調(diào)。E7與 pRb蛋白相互作用可以使這個負反饋環(huán)失活，導致p16上調(diào)，從而促進細胞周期從G1到S期。如今端粒酶的作用也被認為是宮頸癌形成或發(fā)展的主要因素。有研究表明在人惡性腫瘤和被轉(zhuǎn)導的細胞系中端粒酶可被激活，從而得出在人惡性腫瘤的形成中端粒酶的激活是一個關(guān)鍵事件。端粒酶包括 hTERC和 h

3、TERT兩個亞基，前者在端粒延長期間作為模板，后者起催化作用，并具有逆轉(zhuǎn)錄活性。hTERC基因的擴增能阻止細胞凋亡，最終導致腫瘤的發(fā)生。HPV E6可激活hTERT來維持端粒的長度，從而導致細胞的永生化，導致腫瘤的形成。
　　然而，臨床實際工作中卻發(fā)現(xiàn)存在 HPV DNA及 E6/E7mRNA均為陰性的宮頸癌病例。本研究通過對 HPV DNA、E6/E7 mRNA及 p16、p53、hTERC進行檢測，旨在探討HPV檢測陰性SCC

4、的存在，并深入分析三個指標在HPV檢測陰性SCC中的表達及意義。
　　目的：
　　通過對HPV DNA、E6/E7mRNA的檢測，從而得出人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma viruse,HPV）檢測陰性子宮頸鱗癌的存在；檢測p16、p53、hTERC在HPV檢測陰性子宮頸鱗癌中的表達情況，探討其與HPV檢測陰性子宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為研究HPV檢測陰性子宮頸鱗癌的發(fā)病機制及治療提供新的方向。
　

5、　材料及方法：
　　1.研究對象：本研究收集的樣本均來自河南省人民醫(yī)院（河南省鄭州市）病理科檔案室，為2013年10月-2015年05月經(jīng)福爾馬林溶液固定、石蠟包埋的宮頸組織標本。所選的病例其年齡大致在18-65歲之間，其中位年齡約為42歲。這些病例所對應的病人之前未曾檢查過或者未發(fā)現(xiàn)患有宮頸疾病。收集宮頸組織蠟塊875例。本研究已通過河南省人民醫(yī)院倫理委員會的同意并取得了病人或病人家屬的同意及簽字。
　　2.研究方法：應用

6、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法對875例石蠟包埋的宮頸組織進行處理，染色結(jié)果由三名病理科年資較高的診斷醫(yī)生進行評估，最后綜合三名醫(yī)生的評估結(jié)果做出最后診斷，診斷結(jié)果分為四組：225例正?；蜓装Y病變(normal or inflammatory,NNL)；低級別宮頸鱗狀上皮病變（The Low Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL）總共

7、有210例，高級別宮頸鱗狀上皮病變（ The High Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL）總共有200例，宮頸鱗狀細胞癌(Squamous Cell Carcinoma of The Cervix,SCC)總共有240例。排除225例NNL病例。分別應用PCR-反向雜交法、bDNA技術(shù)對210例LSIL、200例HSIL及240例SCC宮頸組織樣本進行HPV型別

8、及E6/E7 mRNA的檢測，隨后對15例HPV（-）（15例DNA-/mRNA-）及25例HPV（+）（包括5例DNA-/mRNA+、20例DNA+/mRNA+）SCC樣本進行p53、p16免疫組化染色及hTERC基因的FISH檢測。
　　3.統(tǒng)計學方法：本研究采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件（美國SPSS公司）進行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗、Kruskal-Wallis秩和檢驗等方法進行數(shù)據(jù)處理，其中P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

9、>　　結(jié)果：
　　1.HPV DNA檢測結(jié)果:本研究對650例宮頸組織樣本進行HPV DNA檢測及分析。HPV總檢出率是94.62%（615/650）；LSIL、HSIL、SCC中，HPV檢出率分別是95.24%（200/210）、100%（200/200）、89.58%（215/240），其中后者較前兩者低，三者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.00）；LSIL組與 HSIL組、LSIL組與SCC組、HSIL組與SCC組分別進行比

10、較，結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.宮頸組織中E6/E7 mRNA的表達情況:E6、E7是HPV致癌的關(guān)鍵基因，當HPV DNA整合入宿主細胞基因時可導致E6、E7過表達，因此E6/E7 mRNA的檢測可表明HPV的感染狀態(tài)。本研究數(shù)據(jù)顯示：各病變級別之間，E6/E7 mRNA百分比存在明顯差異，具有正相關(guān)性（r=0.39，P=0.00）。對LSIL組與HSIL組、LSIL組與SCC組、HSIL組與SCC組中

11、的mRNA百分比分別進行比較，結(jié)果顯示第一組的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.054）,LSIL與SCC、HSIL與SCC之間的mRNA百分比均存在明顯差異（P<0.001）。
　　3.HPV DNA與E6/E7 mRNA的相關(guān)分析:本研究對SCC病例中HPV DNA及E6/E7 mRNA進行分析,結(jié)果顯示存在87.5%DNA+/mRNA+病例、6.25%DNA-/mRNA-病例、2.08%DNA+/mRNA-病例、4.17%DNA-/

12、mRNA+病例。而對于 HSIL來說， DNA+/mRNA+病例百分比在 SCC中相對較高，而DNA-/mRNA-病例百分比在 SCC中相對較低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　4.HPV DNA與E6/E7 mRNA的差異分析:本研究對各宮頸病變級別中的HPV DNA陽性率及E6/E7 mRNA陽性率進行對比分析。對于本實驗中650例宮頸組織樣本來說，HPV DNA、E6/E7 mRNA的檢出率分別是94.62%、

13、71.54%，兩者之間進行比較分析，結(jié)果是具有統(tǒng)計學差異的（P<0.001）。LSIL中，HPV DNA檢出率大于 E6/E7 mRNA檢出率，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.001）；與 LSIL中的差異相類似，HSIL中的HPV DNA檢出率也大于E6/E7 mRNA檢出率，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.001）；在SCC中，HPV DNA陽性率小于E6/E7 mRNA陽性率，且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.008）
　　5.p53、

14、p16及hTERC基因的檢測結(jié)果:本研究對HPV（-）組和HPV（+）組的SCC宮頸組織樣本均進行了p53、p16免疫組化染色和hTERC基因的FISH檢測，結(jié)果顯示：p53在HPV（-）組和HPV（+）組的陽性百分比分別為66.67%、40%，兩組之間p53陽性百分比無明顯差異（χ2=2.667，P=0.102）；兩組中， p16陽性百分比分別為66.67%、100%，差異具有統(tǒng)計學意義（校正χ2=6.72， P=0.01）。hTER

15、C基因檢測結(jié)果顯示：hTERC基因陽性表達率分別為66.67%HPV（-）組、80%HPV（+）組，差異無統(tǒng)計學意義（校正χ2=0.32，P=0.572）。
　　結(jié)論：
　　1.存在HPV DNA及E6/E7 mRNA均為陰性的子宮頸鱗狀細胞癌，即HPV檢測陰性子宮頸鱗狀細胞癌。
　　2.與HPV檢測陽性SCC相比，HPV檢測陰性SCC的形成中p53、hTERC表達無明顯差別，而p16表達較弱,其臨床意義和機制需要進一