P2X7受體對大鼠心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)及心功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠狀動脈內(nèi)不穩(wěn)定的粥樣斑塊破潰、血栓形成進(jìn)而造成冠狀動脈完全閉塞引發(fā)的一系列的病理生理改變，作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)的基本類型之一，MI的發(fā)病率、致死率呈逐漸上升趨勢，給全球的公共衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)代研究表明，威脅MI后患者生存與預(yù)后的重要因素為心律失常、心力衰竭(heart failure，HF)

2、等并發(fā)癥，其中約50％的患者死于心肌梗死后的致命性室性心律失常(ventricular arrhythmias，VAs)。
　　MI后室性心律失常的發(fā)生是神經(jīng)重構(gòu)、電重構(gòu)、心肌重構(gòu)、各種細(xì)胞因子表達(dá)等多種病理生理因素共同參與的結(jié)果，隨著研究的不斷深入MI后交感神經(jīng)重構(gòu)同室性心律失常的關(guān)系日益引起廣大學(xué)者的重視，MI發(fā)生后，早期梗死中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)壞死，表現(xiàn)為交感神經(jīng)去支配現(xiàn)象，而后期梗死灶周區(qū)域出現(xiàn)交感神經(jīng)再生及過度再生，表現(xiàn)為交

3、感神經(jīng)高支配現(xiàn)象，進(jìn)而在梗死的區(qū)域存在著交感神經(jīng)分布與功能的顯著性差異及離散，這種不均一改變即構(gòu)成了室性心律失常發(fā)生的神經(jīng)基質(zhì)，導(dǎo)致MI后室性心律失常的易感性明顯升高。此外，交感神經(jīng)過度激活，兒茶酚胺類活性物質(zhì)分泌增多，細(xì)胞毒性增加，心肌細(xì)胞凋亡、壞死，對心功能也造成了一定的影響。因此，MI后交感神經(jīng)重構(gòu)在室性心律失常發(fā)生、心功能改變的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其機(jī)制研究具有重要的臨床意義。
　　目前，越來越多的證據(jù)表明炎癥和相

4、關(guān)的細(xì)胞因子在刺激神經(jīng)軸突生長和再生的過程中起關(guān)鍵作用，參與并影響著MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的過程。嘌呤能離子通道型受體7(purinergic ligand-gated ion channel7 receptor，P2X7R)在體內(nèi)眾多器官、組織及細(xì)胞中普遍分布，在多種炎性病理狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)與釋放，已陸續(xù)證實(shí)P2X7R與多種炎癥性疾病有著密切的關(guān)系，拮抗P2X7R的表達(dá)對炎癥性疾病的具有一定的治療作用，除此之外，大量

5、研究表明P2X7R參與調(diào)控大腦皮層神經(jīng)元損傷過程，抑制其表達(dá)能夠改善炎癥反應(yīng)加劇的神經(jīng)退行性變，因此，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要病理生理學(xué)功能，然而，P2X7R是否參與MI后的交感神經(jīng)重構(gòu)的過程尚未有相關(guān)研究。
　　現(xiàn)已證實(shí)P2X7R的激活刺激細(xì)胞信號分子發(fā)生磷酸化，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化，從而觸發(fā)活性氧產(chǎn)生、核因子kappaB(NF-κB)活化。NF-κB是

6、多種免疫應(yīng)答的中樞調(diào)節(jié)劑，是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在正常條件下，NF-κB與細(xì)胞質(zhì)中NF-κB的抑制劑(IκB)結(jié)合，激活后，IκB蛋白被降解，游離的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，一些學(xué)者已經(jīng)在MI后心臟組織中檢測到活化的NF-κB，我們團(tuán)隊(duì)以往的工作證明MI發(fā)生后激活NF-κB，PDTC抑制NF-κB活化后通過下調(diào)NGF(nervegrowth fact

7、or，NGF)表達(dá)來改善交感神經(jīng)重構(gòu)，另有學(xué)者通過觀察NF-κBp65的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)嘌呤能信號可以通過P2X7R來激活NF-κB。
　　這意味著P2X7R或許參與心肌缺血壞死后的炎癥過程，以及潛在地參與NF-κB變化調(diào)節(jié)，但是P2X7R是否直接參與MI后的交感神經(jīng)重構(gòu)仍然是未知的。在本項(xiàng)研究中，我們假設(shè)MI后P2X7R激活通過參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)進(jìn)而參與神經(jīng)重構(gòu)的過程，首先檢測了大鼠MI后梗死灶周組織P2X7R的動態(tài)表達(dá)，其次，我們

8、利用基因干擾技術(shù)沉默P2X7R表達(dá)進(jìn)一步觀察了其在大鼠MI后交感神經(jīng)重構(gòu)中的作用及相關(guān)機(jī)制，同時(shí)，我們觀察了P2X7R對大鼠MI后心功能及室性心律失常易感性的影響，該研究或許將為抑制MI后心臟交感神經(jīng)重構(gòu)、減少M(fèi)I后惡性室性心律失常的發(fā)生、改善心功能提供新的理論依據(jù)及治療靶點(diǎn)，為了系統(tǒng)闡述以上問題，本研究將分為以下兩部分展開實(shí)驗(yàn)并探討:
　　第一部分:大鼠心肌梗死后P2X7受體的表達(dá)
　　研究目的:
　　建立大鼠心肌梗

9、死模型，明確心肌梗死灶周組織P2X7R的動態(tài)表達(dá)過程，進(jìn)而為明確P2X7R是否參與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的研究打下基礎(chǔ)，為梗死后室性心律失常、心力衰竭的防治提供新的治療靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　將27只SD大鼠通過開胸永久性結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制作心肌梗死的模型，空白對照組（sham組）只開胸前降支穿線不結(jié)扎，將存活大鼠按照取材時(shí)間隨機(jī)分為以下6組:0-MI組，0.5-MI組，1-MI組，3-MI組，5-MI組和7-MI

10、組及各組的空白對照組:即在MI后即刻、0.5天、1天、3天、5天、7天后進(jìn)行處死，選取大鼠心肌梗死灶周組織通過Western blot、實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測P2X7R蛋白及mRNA表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　造模過程中大鼠心電監(jiān)測示ST段抬高，提示心肌梗死造模成功，Westemblot、實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測提示大鼠在心肌梗死后0.5天P2X7R表達(dá)輕微上調(diào)，在1天時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)，直至第7天一直保持在高水平。
　

11、　研究結(jié)論:
　　大鼠MI后梗死灶周組織存在P2X7R動態(tài)表達(dá)，在梗死后0.5天表達(dá)輕度上調(diào)，在第1至第7天表達(dá)仍保持在較高水平，這提示P2X7R有可能通過調(diào)節(jié)心肌梗死后炎癥因子的表達(dá)參與梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)的調(diào)節(jié)。
　　第二部分:P2X7受體對大鼠心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)及心功能的影響及機(jī)制
　　研究目的:
　　通過向MI大鼠梗死灶周組織注射Ad-P2X7R-shRNA干預(yù)P2X7R表達(dá)，明確P2X7R是否參與梗死

12、后炎性因子表達(dá)、交感神經(jīng)重構(gòu)的過程，以及明確這一過程是否通過NF-κB途徑介導(dǎo);闡明P2X7R參與MI后交感神經(jīng)重構(gòu)的部分機(jī)制;進(jìn)一步探索干擾P2X7R表達(dá)對降低MI后室性心律失常易感性、改善心功能的治療意義。
　　研究方法:
　　將75只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）(n=15)，MI-vehicle組（MI+0.9％NS組）， MI-GFP組（MI+Ad-GFP組）和MI-shRNA組(MI+Ad-P2X7R-s

13、hRNA組)（n=20/組）。成功構(gòu)建MI模型后，各組在左心室的梗死灶周心肌注射等量溶液（80μl;2.5×1011 vg/ml）。其中，sham組未做處理，MI-vehicle組接受生理鹽水注射，MI-GFP組接受Ad-GFP-shRNA注射，MI-shRNA組接受Ad-P2X7R-shRNA注射，在MI后第7天請超聲心動圖專家進(jìn)行血液動力學(xué)測量并采用程序性電刺激誘發(fā)心律失常進(jìn)行電生理測試，然后處死大鼠，收集心肌組織樣品用于以下檢測。

14、
　　1.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測心肌中P2X7R mRNA表達(dá);
　　2.Western blot檢測心肌組織中P2X7R、Akt、Ser473、ERK1/2、NF-κ Bp65、NF-IkBα、NGF、TH、GAP43蛋白表達(dá);
　　3.采用免疫組織化學(xué)方法觀察CD68、IL-1β表達(dá)，了解炎性細(xì)胞浸潤及炎癥因子表達(dá)情況;
　　4.通過Masson染色，在心臟組織切片上評估梗死面積;
　　5.免疫熒光檢

15、測Ad-P2X7R-shRNA心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果、觀察TH、GAP43陽性神經(jīng)纖維的形態(tài)及分布了解交感神經(jīng)再生情況;
　　6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測心肌中NE的濃度，了解梗死灶周交感神經(jīng)活性。
　　研究結(jié)果:
　　1.心臟血液動力學(xué)參數(shù):
　　同sham組相比，MI-vehicle組和MI-GFP組大鼠LVEDP顯著升高，EF值顯著降低，MI各組（MI-vehicle組、MI-GFP組、MI-shRNA組）dP/dt

16、 max和dP/dt min的顯著降低;同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組LVEDP顯著降低，EF值、dP/dt max和dP/dt min顯著升高。
　　2.心臟電生理參數(shù):
　　Sham組、MI-vehicle組、MI-GFP組、MI-shRNA組室性心律失常的誘發(fā)率分別為20％、62.5％、66.7％、29.4％，同Sham組相比，MI-vehicle組、MI-GFP組大鼠心律失常易感性均明顯升高，且兩組

17、間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組大鼠心律失常易感性明顯降低。
　　3.P2X7R mRNA及蛋白表達(dá)及基因沉默效果:
　　GFP熒光成像發(fā)現(xiàn)，MI-GFP組、MI-shRNA組的腺病毒載體可成功轉(zhuǎn)染大鼠梗死灶周心肌細(xì)胞;進(jìn)行RT-PCR和Western blot檢驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，同Sham組相比，MI-vehicle組、MI-GFP組P2X7R的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，且兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)

18、差異，同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組中P2X7R表達(dá)明顯減少，說明以重組腺病毒為載體的P2X7R-shRNA可有效抑制P2X7R的表達(dá)。
　　4.NF-κB信號通路的激活:
　　同sham組相比，MI各組NF-κB p65核蛋白表達(dá)上調(diào)，IκBα胞質(zhì)蛋白中表達(dá)降低，NF-κB發(fā)生核易位，提示MI后NF-κB信號通路顯著激活;同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組中核蛋白NF-κB p65表達(dá)減少，

19、胞質(zhì)蛋白中IκBα含量表達(dá)增加，NF-κB核易位減弱，提示MI后P2X7R RNAi可抑制NF-κB信號通路激活。同時(shí)NF-κB的上游激活分子磷酸Akt(Ser473)和磷酸Erk1/2水平變化同上述NF-κB核易位變化趨勢相一致，說明MI后P2X7R通過Akt和Erk1/2信號途徑調(diào)節(jié)NF-κB的激活表達(dá)。
　　5.梗死灶周炎性細(xì)胞浸潤及炎癥因子IL-1β的表達(dá):
　　同sham組相比，MI各組CD68陽性巨噬細(xì)胞和IL-

20、1β的表達(dá)顯著增加，提示梗死灶周炎性浸潤明顯;同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組CD68陽性巨噬細(xì)胞和IL-1β表達(dá)顯著減少，提示MI后沉默P2X7R表達(dá)可使炎性浸潤程度明顯減弱，炎癥因子表達(dá)減少。
　　6.NGF蛋白表達(dá):
　　同sham組相比，MI各組NGF蛋白表達(dá)明顯升高;同MI-vehicle組相比，MI-shRNA組NGF蛋白表達(dá)明顯減弱。
　　7.神經(jīng)纖維分布及蛋白表達(dá):
　　(1) G

21、AP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組GAP43陽性神經(jīng)纖維少見甚至是缺如;同Sham組相比較，MI各組GAP43陽性神經(jīng)纖維的密度顯著增加;同MI-GFP組相比，MI-shRNA組神經(jīng)纖維的密度明顯降低。(2) TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組TH陽性神經(jīng)纖維均勻的分布于心肌纖維間，并且同心肌纖維保持走形一致;同Sham組相比較MI各組TH陽性神經(jīng)纖維的密度明顯增加，形態(tài)粗大，而且在空間分布上表現(xiàn)混亂，兩組之間表現(xiàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同MI-vehi

22、cle組相比，MI-shRNA組TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯降低，形態(tài)及分布更趨于正常。
　　8.心肌組織中NE濃度
　　同sham組相比，MI-vehicle組及MI-GFP組的梗死灶周的心肌NE水平明顯升高，在P2X7R沉默后，梗死灶周NE水平顯著低于MI-vehicle組，即MI-vehicle組和MI-GFP組交感神經(jīng)活性明顯升高，沉默P2X7R表達(dá)后交感神經(jīng)活性降低趨于正常。
　　研究結(jié)論:
　　1.P2X

23、7R在MI后表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)Akt(Ser473)和Erk1/2磷酸化，激活NF-κB信號通路，增加IL-1β表達(dá)，上調(diào)NGF表達(dá)，參與交感神經(jīng)重構(gòu);增加MI后室性心律失常易感性、心功能惡化。
　　2.運(yùn)用Ad-P2X7R-shRNA在梗死灶周局部注射可成功沉默P2X7R基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　3.MI發(fā)生后采用短發(fā)卡RNA技術(shù)沉默P2X7R表達(dá)，可抑制Akt(Ser473)和Erk1/2磷酸化及下游NF-κB信號通路激活，下調(diào)I