嶺南溫病濕熱證小鼠模型的建立及腸道相關濕熱證實質(zhì)的研究.pdf

1、目的:
　　濕熱證是嶺南地區(qū)常見的體質(zhì)類型和疾病發(fā)病類型，嶺南地區(qū)沿海濕氣大，山川丘陵眾多使?jié)裥安簧⒁着c熱邪相合而攻于人體。薛生白《濕熱病篇》指出“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”，濕熱證的發(fā)病機制存在著脾胃內(nèi)傷的誘因，故嶺南地區(qū)高蛋白的飲食習慣可能與脾胃內(nèi)傷有特殊的相關性。本研究擬通過建立具有嶺南特色的溫病濕熱證小鼠模型為研究溫病濕熱證的基礎，探索溫病濕熱證的腸道菌群組成變化規(guī)律、體內(nèi)炎癥反應狀態(tài)和水通道蛋白的

2、改變情況，選擇清熱利濕代表方茵陳蘺湯進行反證，并探索茵陳蒿湯的清熱利濕機制，推進中醫(yī)藥治療溫病濕熱證的科學性的發(fā)展。
　　方法:
　　建立兩種不同發(fā)病機制的嶺南溫病濕熱證小鼠模型:通過運用“高蛋白飼料+糖水”模擬嶺南飲食習慣特點，模型A組給予油脂灌胃模擬好食肥甘厚膩之人群，模型B組則給予番瀉葉灌胃模擬常服清熱解毒之品人群，酒的作用為加劇內(nèi)濕熱程度，綜合以上形成內(nèi)濕熱因素;氣候箱模擬嶺南外環(huán)境的濕度溫度，再加于LPS的腹腔注射

3、模擬外來戾氣，以“內(nèi)傷濕熱+外傷濕熱+外來疬氣”的模式建立嶺南溫病濕熱證小鼠模型，用HE染色法來觀察小鼠舌苔和結(jié)腸組織學的改變、用ELISA法檢測血清和結(jié)腸LPS、TNF-α的含量變化、用相對定量PCR法檢測小鼠糞便中五種腸道細菌的含量變化、用RT-PCR法檢測結(jié)腸組織TLR4、CD14、AQP3、AQP8的表達水平變化。選擇茵陳蒿湯對建立的兩種溫病濕熱證小鼠模型進行反證治療，并通過血清TNF-α的含量的檢測和結(jié)腸組織TLR4、CD14

4、的表達變化來探索茵陳蒿湯清熱作用的炎癥信號通路機制，通過結(jié)腸組織AQP3、AQP8的表達變化來探索茵陳蒿湯利濕作用的機制。
　　結(jié)果:
　　兩種嶺南溫病濕熱證小鼠模型均出現(xiàn)了濕熱證相關的癥狀體征，血清、結(jié)腸TNF-α均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)，提示溫病濕熱證模型建模成功。模型完成初期(6h)，模型A組血清LPS含量低于單純LPS組(P＞0.05)，模型B組血清LPS含量低于單純LPS組(P＜0.05)，推測可能是兩組模型

5、均出現(xiàn)過腸道細菌移位入血，細菌LPS使機體產(chǎn)生了LPS耐受，引起模型組血液內(nèi)LPS含量降低;兩組模型結(jié)腸組織TLR4mRNA、CD14mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)升高，結(jié)腸組織AQP3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)降低，AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)升高，提示了溫病濕熱證出現(xiàn)TLR4通路的激活和水通道蛋白表達的紊亂。
　　兩種溫病濕熱證模型腸道菌群的檢測結(jié)果顯示，兩組模型均出現(xiàn)大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬含量增加，大腸桿菌屬含量升高最為明顯;雙

6、歧桿菌屬和乳桿菌屬含量的表達存在差別，模型A組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬出現(xiàn)含量增加而模型B組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬出現(xiàn)含量降低;以上提示溫病濕熱證存在腸道菌群的失調(diào)。
　　茵陳蒿湯的清熱機理探索，茵陳蒿湯治療7天后，治療組A組、治療組B組的小鼠相關濕熱證癥狀體征出現(xiàn)明顯改善。研究結(jié)果顯示，治療組A組、治療組B組血清中TNF-α含量均低于鹽水組A組、鹽水組B組(P＜0.05)，提示茵陳蒿湯有抗炎的效果;相比鹽水組A組、鹽水組B組，治療A組

7、、治療B組的結(jié)腸組織TLR4mRNA、CD14mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的下降，提示茵陳蒿湯抗炎的作用機制之一是通過TLR4通路來下調(diào)TLR4mRNA、CD14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平而實現(xiàn)，抗炎可能是茵陳蒿湯清熱作用的機制之一。
　　茵陳蒿湯的利濕機理探索，茵陳蒿湯治療7天后，治療組A組、治療組B組的小鼠飲水飲食量均出現(xiàn)不同程度的增加，糞便色褐質(zhì)軟硬適中，排便時糞便不伴有拖尾排不盡現(xiàn)象，提示了茵陳蒿湯能改善食少納呆、不欲飲、便溏軟

8、等濕熱證的癥狀體征;研究結(jié)果顯示，相比鹽水組A組、鹽水組B組，治療組A組、治療組B組結(jié)腸組織AQP3mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，治療組A組、治療組B組結(jié)腸組織AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，提示茵陳蒿湯能調(diào)節(jié)水通道蛋白的表達量，茵陳蒿湯的利濕作用的機制之一是作用于結(jié)腸組織通過下調(diào)AQP3表達量和上調(diào)AQP8的表達量實現(xiàn)。
　　鹽水組A組、B組分別是模型A組、B組在自然發(fā)展狀態(tài)下7天的表現(xiàn)。相比模型A組、B組

9、，鹽水組A組、B組TLR4mRNA、CD14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，提示溫病濕熱證TLR4通路的激活狀態(tài)隨著時間的進展程度加重;鹽水組A組、B組AQP3mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，鹽水組A組、B組的AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)特異性，鹽水組A組出現(xiàn)AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升，鹽水組B組出現(xiàn)AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，提示可能溫病濕熱證水濕內(nèi)停的病理狀態(tài)的加重與AQP3、AQP8的表達改變有相關性。
　

10、　結(jié)論:
　　兩種嶺南特色溫病濕熱證小鼠模型造模成功，表現(xiàn)出相應的溫病濕熱證癥狀體征。溫病濕熱證存在腸道菌群的失調(diào)狀態(tài)，濕熱證出現(xiàn)大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬等條件致病菌過度增長，而雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等益生菌的含量受濕熱發(fā)病機制的影響出現(xiàn)含量表達的差異，可能致病菌的過度增殖是溫病濕熱證實質(zhì)的病理機制之一。溫病濕熱證的實質(zhì)存在TLR4受體通路的激活和AQP3、AQP8表達的紊亂。茵陳蒿湯具有治療溫病濕熱證的作用，茵陳蒿湯的清熱利濕