益氣除痰方調(diào)控GRP78介導(dǎo)多條信號(hào)通路抑制腫瘤血管新生的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在益氣除痰方(YQCTF)前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)外雙水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討YQCTF對(duì)腫瘤微環(huán)境血管新生作用的分子機(jī)制及GRP78參與血管新生信號(hào)通路調(diào)控作用，為其抗腫瘤血管新生治療提供臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤中心治療抗腫瘤經(jīng)驗(yàn)方Y(jié)QCTF作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。(1)運(yùn)用CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧模擬細(xì)胞腫瘤缺氧微環(huán)境，采用CCK8法確定CoCl2

2、誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧模型條件以及評(píng)估不同濃度YQCTF干預(yù)缺氧微環(huán)境下HUVEC活性的影響;(2)通過(guò)CCK8法確定YQCTF干預(yù)濃度，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)。利用流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)AnnexinⅤ/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)細(xì)胞DNA含量測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞周期，觀察YQCTF對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡和增殖的影響;(3)采用TubeFormation實(shí)驗(yàn)觀察YQCTF對(duì)缺氧HUVEC血管形成的影響;(4)利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察YQCTF對(duì)細(xì)

3、胞遷移侵襲能力和修復(fù)能力的影響。(5)采用QPCR和WesternBlot法檢測(cè)YQCTF對(duì)缺氧HUVEC中血管新生相關(guān)通路HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK mRN水平和蛋白表達(dá)及其磷酸化的水平研究YQCTF對(duì)血管新生的調(diào)控作用。(6)通過(guò)siRNA干擾技術(shù)沉默GRP78探討GRP78參與調(diào)控血管新生的機(jī)制研究.(7)通過(guò)免疫熒光觀察在缺氧、YQCTF干預(yù)及沉默GRP78條件下HUVEC中

4、的GRP78表達(dá)情況，探討YQCTF參與調(diào)控缺氧微環(huán)境細(xì)胞血管新生的分子機(jī)制。
　　體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:選用SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠，構(gòu)建肺腺癌A549細(xì)胞移植瘤裸鼠模型，造移植模型成功后隨機(jī)分為兩組:Control組和YQCTF組。YQCTF組給予每日YQCTF水煎液灌胃，Control組給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥3周，期間定期觀察移植瘤裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)，每3d測(cè)量裸鼠體重、瘤體體積，移植瘤裸鼠于給藥21d后處死，剝離移植瘤

5、瘤體稱量瘤重、計(jì)算抑瘤率，并觀察肺、肝轉(zhuǎn)移情況，評(píng)估YQCTF對(duì)肺癌腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響;采用免疫組化法(IHC)檢測(cè)移植瘤組織微血管密度及血管新生相關(guān)信號(hào)通絡(luò)HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表達(dá)及其磷酸化水平。評(píng)價(jià)YQCTF對(duì)腫瘤血管新生的影響。
　　結(jié)果:
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:(1) CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2隨著時(shí)間延長(zhǎng)、濃度增高，抑制細(xì)胞活力，產(chǎn)

6、生細(xì)胞毒性，選擇對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯抑制活力和增殖的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(100μM，48h)。當(dāng)100μM的CoCl2干預(yù)48h后，細(xì)胞管腔形成、遷移及侵襲能力增強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01);(2) CCK8檢測(cè)結(jié)果提示提示YQCTF能明顯抑制缺氧HUVEC的細(xì)胞活力(P＜0.05，P＜0.01)，并與藥物濃度呈依賴性，并隨著YQCTF濃度升高，HUVEC活力下降;(3)通過(guò)倒置顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示YQCTF可抑制缺氧H

7、UVEC增殖;(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果提示YQCTF呈劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），測(cè)定細(xì)胞DNA含量結(jié)果顯示YQCTF可顯著增加G0/G1期細(xì)胞的比例，降低S和G2/M比例(P＜0.05，P＜0.01)，抑制細(xì)胞分裂增殖;(5)Tube Formation實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示YQCTF可顯著抑制細(xì)胞血管形成(P＜0.05，P＜0.01)。(6)細(xì)胞劃痕結(jié)果表明YQCTF干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞修復(fù)能

8、力（P＜0.05，P＜0.01）。(7) Transwell實(shí)驗(yàn)提示YQCT顯著降低缺氧HUVEC細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲力，可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與藥物濃度呈依賴性（P＜0.05，P＜0.01）;(8) Western blot和QPCR結(jié)果顯示，缺氧微環(huán)境可顯著上調(diào)血管新生相關(guān)通路信號(hào)分子HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK蛋白和mRNA表達(dá)水平，并能增強(qiáng)AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P＜0

9、.05，P＜0.01)。YQCTF干預(yù)后，能顯著下調(diào)細(xì)胞的HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK蛋白和mRNA表達(dá)水平，抑制AKT、ERK1/2、FAK活性，與YQCTF濃度呈依賴性降低（P＜0.05，P＜0.01），提示YQCTF可改善缺氧微環(huán)境，抑制缺氧HUVEC血管生成，其作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)控上述多條信號(hào)通路表達(dá)。(9)免疫熒光結(jié)果顯示，缺氧微環(huán)境下HUVEC的GRP78表達(dá)升高。YQC

10、TF干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的GRP78熒光強(qiáng)度均降低;(10) siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC沉默GRP78表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA GRP78后，HUVEC管腔形成、遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.01）;沉默GRP78后，血管新生相關(guān)通路蛋白HIF-1α、VEGF/VEGFR表達(dá)顯著下調(diào)，抑制AKT、ERK1/2、FAK激活(P＜0.05，P＜0.01)，提示GRP78參與血管新生進(jìn)程，干預(yù)缺氧微環(huán)境，介導(dǎo)血管新生信號(hào)通路調(diào)控，對(duì)腫瘤生

11、長(zhǎng)轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。(11)免疫熒光結(jié)果顯示，沉默GRP78后，胞內(nèi)和胞膜的GRP78熒光強(qiáng)度都明顯降低，提示GRP78可能是血管新生中重要的靶信號(hào)分子。
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:(1)兩組肺癌A549細(xì)胞移植瘤裸鼠模型的體重顯示在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無(wú)明顯差異，YQCTF對(duì)裸鼠體重的生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制，YQCTF可抑制移植瘤瘤體體積(P＜0.05，P＜0.01)，抑制瘤體腫重量(P＜0.01)，顯示YQCTF對(duì)肺癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)有抑制作用。(

12、2)免疫組化結(jié)果顯示，YQFTF組的移植瘤組織微血管密度明顯降低（P＜0.01），提示YQCTF可抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞血管新生。YQCTF組與Control組相比，可明顯抑制體內(nèi)移植瘤細(xì)胞中HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表達(dá)及AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P＜0.05，P＜0.01)，提示YQCTF對(duì)抑制體內(nèi)腫瘤血管新生的J機(jī)制與調(diào)控HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、

13、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信號(hào)通路表達(dá)相關(guān)。與體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立缺氧內(nèi)皮細(xì)胞模型和裸鼠肺腺癌細(xì)胞移植瘤動(dòng)物模型。
　　2.體外HUVEC在缺氧條件下血管新生能力增強(qiáng)，YQCTF可通過(guò)改缺氧微環(huán)境，抑制HUVEC增殖、管腔形成、細(xì)胞遷移和侵襲能力，降低HUVEC血管新生。體內(nèi)YQCTF能顯著降低移植瘤微血管密度，抑制血管生成，抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。
　　3.YQCTF抗