保元解郁方對(duì)模擬航天郁證的防治效果及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:在中長(zhǎng)期航天飛行中，航天員面臨特殊而又復(fù)雜的極端環(huán)境，遭受微重力、噪聲、晝夜節(jié)律改變、狹小環(huán)境、社會(huì)隔離、輻射等特殊環(huán)境因素影響。航天應(yīng)激環(huán)境給乘員的心理帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，容易引起睡眠障礙、疲勞、易怒、情緒不穩(wěn)定、注意力難以集中、焦躁不安、心悸、血壓不穩(wěn)、食欲缺乏等心身癥狀和認(rèn)知變化，影響工作效率和表現(xiàn)，載人航天史中不乏因?yàn)樾睦韱?wèn)題影響工作甚至提前返回的案例。這些心身癥狀符合中醫(yī)郁證的臨床特征，為了區(qū)別于一般臨床上的郁證，我們將

2、其稱為航天郁證。
　　中長(zhǎng)期航天飛行應(yīng)激因素多，心理問(wèn)題機(jī)制復(fù)雜，涉及多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異?；蛭蓙y，針對(duì)單一靶點(diǎn)的防治措施很難取得滿意的療效。中醫(yī)藥具有多系統(tǒng)、多層次、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體功能進(jìn)行調(diào)節(jié)和不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于航天領(lǐng)域有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事航天員醫(yī)監(jiān)醫(yī)保任務(wù)和實(shí)踐，一直致力于中醫(yī)藥在載人航天中的應(yīng)用研究。保元解郁方（BYJYF）是根據(jù)空間站任務(wù)醫(yī)學(xué)需求，針對(duì)長(zhǎng)期航天飛行心理應(yīng)激問(wèn)題，結(jié)合航天員醫(yī)學(xué)監(jiān)督和保障的長(zhǎng)期實(shí)踐

3、，借鑒古今名醫(yī)用藥經(jīng)驗(yàn)，參考現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果，以疏肝解郁、養(yǎng)血理氣、安神寧志為組方原則，擬定出的防治航天郁證的中藥復(fù)方。然而此方對(duì)抗航天郁證的作用及其機(jī)制尚未完全闡明，本研究以此為切入點(diǎn)，塑造航天復(fù)合應(yīng)激大鼠模型，采用多種方法揭示BYJYF水提物在多個(gè)系統(tǒng)和層次上的抗郁效果，深入探討其作用機(jī)制。
　　研究目的和意義:
　　1.創(chuàng)建航天郁證大鼠模型，評(píng)價(jià)其行為學(xué)表現(xiàn)和各系統(tǒng)變化，為研究載人航天飛行任務(wù)中的郁證問(wèn)題提供技術(shù)平臺(tái)

4、。
　　2.闡釋航天郁證的發(fā)生機(jī)制和病理基礎(chǔ)，為其防治提供理論支持。
　　3.評(píng)價(jià)保元解郁方對(duì)模擬航天郁證的干預(yù)效果，從神經(jīng)、內(nèi)分泌、氧化應(yīng)激等不同方面揭示其對(duì)抗航天郁證的作用環(huán)節(jié)，深入研究其潛在干預(yù)機(jī)制，探討作用通路和靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治航天郁證和航天新藥開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:利用神經(jīng)行為學(xué)方法、生化檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、病理切片、抗體芯片、蛋白免疫印跡、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析等手段，

5、從動(dòng)物行為表現(xiàn)、整體應(yīng)激水平和抗氧化水平、腦神經(jīng)遞質(zhì)、組織形態(tài)、蛋白分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多層面探討模擬航天郁證的病理基礎(chǔ)，闡釋BYJYF干預(yù)航天郁證的作用及其機(jī)制。
　　1.動(dòng)物分為空白組（Ctrl）、模型組（Mod）、BYJYF組、鹽酸氟西汀組（Flu）。通過(guò)尾吊、孤養(yǎng)、65dB(A)噪聲暴露、90分鐘明暗周期設(shè)置等方法，模擬失重、隔離、噪聲、晝夜節(jié)律改變等多因素組成的航天復(fù)合應(yīng)激。經(jīng)過(guò)42天模擬航天復(fù)合應(yīng)激和灌胃給藥后，應(yīng)用糖水

6、偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等四個(gè)行為學(xué)方法評(píng)價(jià)大鼠模型的抑郁樣行為，用鹽酸氟西汀做陽(yáng)性對(duì)照藥物，對(duì)BYJYF的三個(gè)劑量組進(jìn)行藥效驗(yàn)證。
　　2.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清應(yīng)激激素CORT、ACTH、NE、DA水平，觀察模擬航天郁證應(yīng)激水平的變化和BYJYF對(duì)應(yīng)激水平的影響。
　　3.用水溶性四唑鹽法、可見(jiàn)光分光光度法、化學(xué)比色法和硫代巴比妥酸法分別檢測(cè)血漿氧化還原酶SOD、CAT、T-AOC活

7、性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的水平，觀察模擬航天郁證大鼠氧化應(yīng)激水平的變化和BYJYF對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響。
　　4.應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定大鼠海馬和大腦皮層組織中7種主要神經(jīng)遞質(zhì) E、NE、DA、5-HT、GABA、Glu、Ach的水平，觀察模擬航天郁證大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化和BYJYF對(duì)腦組織神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。
　　5.通過(guò)對(duì)大腦組織切片進(jìn)行尼氏染色，觀察海馬和大腦皮層組織神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)的變化，

8、評(píng)價(jià)模擬航天郁證和BYJYF對(duì)神經(jīng)元組織形態(tài)的影響。
　　6.應(yīng)用 KAM-850抗體芯片進(jìn)行海馬和大腦皮層組織高通量蛋白組學(xué)檢測(cè)，分析差異蛋白，找出其對(duì)應(yīng)的基因，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，獲取差異表達(dá)基因顯著富集的通路，初步探討B(tài)YJYF的作用通路和靶標(biāo)蛋白。
　　7.按照通路功能對(duì)芯片富集結(jié)果做進(jìn)一步分析，找出與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)的通路，用免疫印跡法對(duì)海馬和大腦皮層勻漿進(jìn)行檢測(cè)，觀察相關(guān)通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變

9、化，對(duì)抗體芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，揭示BYJYF的作用通路和靶標(biāo)蛋白。
　　8.檢索BYJYF所含化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)用藥物CIPHER-CS方法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，預(yù)測(cè)潛在靶標(biāo)并找出相應(yīng)的基因，對(duì)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析，從組分角度預(yù)測(cè)BYJYF的作用靶標(biāo)，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較和匯總分析，進(jìn)一步明確BYJYF的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.采用四個(gè)因素模擬長(zhǎng)期航天復(fù)合應(yīng)激，引起大鼠糖水偏好率降低，曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)平

10、均速度降低，MWM定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和游程延長(zhǎng)，MWM空間搜索實(shí)驗(yàn)原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間百分比明顯減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和攀爬次數(shù)減少。航天郁證模型大鼠具有快感缺失、情緒低落、行為絕望、學(xué)習(xí)記憶能力下降等抑郁樣反應(yīng)和認(rèn)知下降表現(xiàn)。BYJYF能夠減輕抑郁樣反應(yīng)發(fā)生程度，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，效果不亞于鹽酸氟西汀。
　　2.航天郁證模型大鼠血清NE、DA、CORT、ACTH水平和MDA水平升高，SOD、CAT、T-A

11、OC活性降低，交感神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸活性以及氧化應(yīng)激水平增加。BYJYF可以防止或減輕這些指標(biāo)的變化，降低應(yīng)激反應(yīng)水平，減輕氧化應(yīng)激損傷。
　　3.航天郁證模型大鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)NE、E、DA、5-HT和GABA的含量和海馬NE和5-HT的含量減少，大腦皮層Glu、Ach的含量和海馬Ach的含量增加。BYJYF對(duì)大腦皮層和海馬多種神經(jīng)遞質(zhì)水平有調(diào)節(jié)作用。
　　4.航天郁證模型大鼠海馬CA3區(qū)和大腦皮層神經(jīng)元數(shù)

12、量減少，間隙變大，排列稀疏散亂，染色變?nèi)?，尼氏體減少。BYJYF可以有效減輕海馬和皮層神經(jīng)元數(shù)目和形態(tài)的改變，減輕神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　5.在854個(gè)蛋白分子中，海馬組織中Mod組和BYJYF組顯著差異蛋白分別是51個(gè)和37個(gè)，集中于MAPK、mTOR、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和p53等信號(hào)傳導(dǎo)通路；大腦皮層組織中分別是28個(gè)和43個(gè)，集中于MAPK、p53、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、mTOR等信號(hào)傳導(dǎo)通路。Mod組 MAPK和 p53通

13、路在海馬和大腦皮層中活性變化都很明顯；BYJYF組MAPK、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和mTOR通路活性在海馬和大腦皮層中都發(fā)生了明顯變化。其中MAPK和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)。
　　6. MAPK通路上的關(guān)鍵蛋白變化：1）海馬組織：航天郁證模型p-ERK1/2和p-p38 MAPK蛋白水平均升高，BYJYF可使其水平降低。2）大腦皮層組織：BYJYF組ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平升高。結(jié)果提示，模擬航天郁證ERK

14、和p38 MAPK通路上調(diào)，BYJYF下調(diào)了海馬ERK和p38 MAPK通路，對(duì)皮層的影響有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　7.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路上的關(guān)鍵蛋白變化：1）海馬組織：航天郁證模型p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-CREB、BDNF水平顯著降低，p-GSK-3β水平顯著升高；BYJYF可明顯減輕這些蛋白水平的變化幅度。2）大腦皮層組織：航天郁證模型p-CREB沒(méi)有明顯變化；BYJYF組p-CREB水平有所升高，其他蛋白變化趨

15、勢(shì)與海馬組織一致。結(jié)果提示，模擬航天郁證神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路下調(diào)，BYJYF可以上調(diào)大腦皮層和海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路。
　　8.共收集到BYJYF八味中藥所含的814個(gè)小分子化合物，包括水溶性成分412個(gè)，得到588個(gè)潛在靶標(biāo)蛋白。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，在17類通路中，神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、血管平滑肌收縮相關(guān)通路、鈣信號(hào)通路與神經(jīng)功能或應(yīng)激密切相關(guān)。GO功能注釋分析中，細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞膜、離子通道等功能富集區(qū)也與神經(jīng)系統(tǒng)密切相

16、關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.尾吊、孤養(yǎng)、65dB(A)噪聲暴露、90分鐘明暗周期更替等四個(gè)因素疊加模擬長(zhǎng)期航天復(fù)合應(yīng)激能夠誘導(dǎo)大鼠抑郁樣反應(yīng)，此方法可以成功構(gòu)建航天郁證模型。
　　2.模擬航天郁證大鼠具有抑郁樣反應(yīng)和認(rèn)知功能下降表現(xiàn)，應(yīng)激反應(yīng)和氧化應(yīng)激明顯，神經(jīng)遞質(zhì)水平失調(diào)，大腦皮層和海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷。模擬航天郁證與神經(jīng)和內(nèi)分泌、氧化還原和神經(jīng)遞質(zhì)水平失調(diào)，以及神經(jīng)元損傷相關(guān)。
　　3. BYJYF能夠減輕交

17、感神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活和機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)腦神經(jīng)遞質(zhì)水平，減輕神經(jīng)元損傷，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)和內(nèi)分泌、抗氧化、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和保護(hù)神經(jīng)元等多種途徑減輕抑郁樣反應(yīng)、改善認(rèn)知，對(duì)抗模擬航天郁證作用明顯。
　　4. BYJYF可通過(guò)下調(diào) MAPK通路和上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路，提高大腦 BDNF水平并激活 CREB來(lái)改善神經(jīng)可塑性，減輕應(yīng)激和炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元存活，從而保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)抗航天郁證。
　　5

18、.針對(duì)航天郁證多系統(tǒng)的病理生理改變進(jìn)行中醫(yī)辯證，依據(jù)疏肝解郁、養(yǎng)血理氣、安神寧志的治則擬定的保元解郁方具有多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、多途徑整體綜合調(diào)理的效用優(yōu)勢(shì)，辨證合理，組方科學(xué)，療效顯著，具有很好的研發(fā)和應(yīng)用前景。
　　創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.首次通過(guò)尾吊、孤養(yǎng)、65dB(A)噪聲暴露、90分鐘明暗周期設(shè)置等方法建立航天郁證動(dòng)物模型，此模型將為研究載人航天飛行中的郁證問(wèn)題提供技術(shù)平臺(tái)和理論支持。
　　2.首次從神經(jīng)行為學(xué)、生物化學(xué)