NMDA-nNOS-JNK通路介導(dǎo)的Vc中神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞間通訊在心理應(yīng)激致大鼠咬肌痛敏中的作用.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會(huì)的不斷發(fā)展，生活節(jié)奏的不斷加快，心理因素在多種疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用日益受到人們的廣泛關(guān)注。大量研究證實(shí)，心理應(yīng)激與多種全身性疾病的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)關(guān)系。目前，心理應(yīng)激對(duì)口腔頜面部影響的研究已逐漸明確：心理應(yīng)激可以加重牙周炎發(fā)展，延遲口腔黏膜疾病的愈合，甚至引起咀嚼肌肌肉緊張度增高等。然而，口腔頜面部最常見疾病之一的慢性口頜面痛，因其病因復(fù)雜、影響因素眾多等，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。
　　頭面部痛覺傳導(dǎo)通路的第一

2、級(jí)神經(jīng)元是位于三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)的假單級(jí)神經(jīng)元，其周圍突分布于頭面部感受器，中樞突止于三叉神經(jīng)脊束核。研究表明，三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核在口頜面部傷害性信息的傳遞和調(diào)節(jié)中處于重要地位。基于此，本課題組開展系列研究，并已明確三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激致咬肌區(qū)痛覺敏感過程中發(fā)揮著一定的作用。研究也證實(shí)，口頜面部受到傷害性刺激后，三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中神經(jīng)元明顯活化，且神經(jīng)元上的谷氨酸NMDA受體在突觸傳遞中發(fā)揮重要作用，能夠

3、參與神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。然而，口頜面部疼痛中NMDA受體介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的具體機(jī)制尚未可知。此外，研究表明，神經(jīng)損傷后脊髓背角內(nèi)MAPK家族中的JNK成員表達(dá)顯著上調(diào)，且特異分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。那么，在口頜面部疼痛狀態(tài)下，三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中NMDA受體對(duì)JNK的活化是否有一定的作用？基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)：
　　第一部分、心理應(yīng)激模型的建立與評(píng)價(jià)及其對(duì)大鼠咬肌痛敏影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　首先，采用完

4、全隨機(jī)法將64只大鼠分為：空白對(duì)照組，心理應(yīng)激1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天組，每組8只。心理應(yīng)激組大鼠每天給予8小時(shí)束縛應(yīng)激，對(duì)照組大鼠不作束縛處理。結(jié)果顯示：心理應(yīng)激能夠?qū)е麓笫篌w重增長量下降；負(fù)性情緒增多，表明模型建立成功。隨后，采用Von Frey纖維絲對(duì)每組大鼠的咬肌區(qū)域進(jìn)行刺激以檢測(cè)其咬肌區(qū)痛覺閾值的變化。結(jié)果顯示：慢性束縛應(yīng)激能夠使大鼠咬肌區(qū)的機(jī)械性痛覺閾值明顯下降，證實(shí)了心理應(yīng)激與慢性口頜面部疼痛的相關(guān)關(guān)系

5、。
　　第二部分、NMDA-nNOS-JNK通路在心理應(yīng)激致大鼠咬肌痛敏中的作用
　　首先采用免疫熒光組織化學(xué)方法檢測(cè)心理應(yīng)激對(duì)大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中Fos蛋白（神經(jīng)元活化的指標(biāo)）、GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的指標(biāo)）表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：束縛應(yīng)激1天時(shí)大鼠Vc內(nèi)Fos蛋白表達(dá)量顯著升高，持續(xù)一周后逐漸恢復(fù)到正常水平，且絕大多數(shù)Fos蛋白均表達(dá)在NeuN陽性的神經(jīng)元上；而GFAP則是在束縛應(yīng)激3天時(shí)逐漸升高，7天與14天

6、時(shí)顯著增多，提示束縛應(yīng)激刺激可以有效激活三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。為進(jìn)一步證實(shí)Vc內(nèi)的神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感中的作用，我們將每個(gè)應(yīng)激組又分為3個(gè)亞組，每組4只動(dòng)物，分別給予生理鹽水（對(duì)照組）、ASO（阻斷Fos蛋白）、LAA（阻斷GFAP），于每日上午束縛前10分鐘給藥，1次/天，給藥天數(shù)同束縛天數(shù)，考慮到藥物的持續(xù)作用，14天組只連續(xù)給藥11天，后3天只給予束縛處理。每個(gè)亞組于處理前、處

7、理相應(yīng)的天數(shù)結(jié)束后進(jìn)行痛覺閾值測(cè)定，并進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)。結(jié)果顯示：兩種阻斷劑均可顯著緩解應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感現(xiàn)象，且ASO明顯抑制束縛應(yīng)激后Vc內(nèi)Fos蛋白與GFAP的表達(dá)， LAA能夠抑制束縛應(yīng)激后Vc內(nèi)GFAP的表達(dá)上調(diào)，并縮短Fos蛋白的表達(dá)時(shí)程。以上結(jié)果提示，心理應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠Vc內(nèi)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，且神經(jīng)元的活化早于星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化不僅作為神經(jīng)元活化的下游現(xiàn)象，并可能影響神經(jīng)元活化

8、，二者相互作用，促進(jìn)心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感的發(fā)展。
　　隨后，我們對(duì)心理應(yīng)激后Vc內(nèi)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。為探明星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK的活化是否參與心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感的過程，我們?cè)诮?4天后采用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)和Western blotting技術(shù)檢測(cè)pJNK的表達(dá)情況以及其與GFAP是否共存，之后通過鞘內(nèi)置管給予JNK抑制劑并檢測(cè)給藥后咬肌區(qū)痛覺閾值的變化。結(jié)果顯示：束縛應(yīng)激14

9、天后，pJNK表達(dá)顯著升高，且其與GFAP幾乎完全共存，Western blotting結(jié)果也表明，束縛應(yīng)激后pJNK-1表達(dá)水平顯著升高，且JNK抑制劑能顯著抑制應(yīng)激大鼠的咬肌區(qū)機(jī)痛覺敏感。上述研究證實(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK的活化在心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感過程中起關(guān)鍵作用。此外，我們進(jìn)一步探討了神經(jīng)元上的NMDA受體是否參與心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感及誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK的活化過程。束縛應(yīng)激14天后采用免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)N

10、R2B與NeuN的雙標(biāo)情況、GFAP與NR2B的雙標(biāo)情況，并采用Western blotting檢測(cè)pNR2B的表達(dá)情況；之后通過鞘內(nèi)置管給予拮抗劑MK-801（阻斷NMDA）、ifenprodil（阻斷NR2B）與生理鹽水后檢測(cè)大鼠咬肌區(qū)痛覺閾值的變化，并通過Western blotting檢測(cè)給藥后pJNK的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NR2B亞單位與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN大量共存，且束縛應(yīng)激后NR2B亞單位磷酸化水平顯著高于對(duì)照組。此外，兩

11、種抑制劑不僅可以緩解應(yīng)激大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感，還能顯著抑制應(yīng)激后JNK的磷酸化。以上結(jié)果說明，神經(jīng)元上的NMDA受體參與心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感的傳導(dǎo)，并能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中JNK的活化。
　　為進(jìn)一步探討NMDA誘導(dǎo)的JNK活化是否依賴于nNOS-GC-cGMP途徑，我們于束縛應(yīng)激14天后鞘內(nèi)給予nNOS抑制劑7-NINA及GC抑制劑ODQ后檢測(cè)大鼠咬肌區(qū)痛覺閾值的變化，并通過Western blotting檢測(cè)給藥后pJNK

12、的變化。結(jié)果顯示：鞘內(nèi)給予7-NINA與ODQ均能有效緩解束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感，且7-NINA與ODQ處理均能顯著抑制pJNK的表達(dá)水平。該結(jié)果表明束縛應(yīng)激后NMDA誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞JNK的活化依賴于nNOS-GC途徑。
　　研究結(jié)論：
　　1、束縛應(yīng)激可以引起動(dòng)物機(jī)體一系列應(yīng)激性變化，產(chǎn)生心理應(yīng)激狀態(tài)，應(yīng)用束縛應(yīng)激可以有效建立慢性心理應(yīng)激動(dòng)物模型。
　　2、心理應(yīng)激能夠降低大鼠咬肌區(qū)機(jī)械性痛覺閾值，證實(shí)了

13、心理應(yīng)激與慢性口面部疼痛的相關(guān)關(guān)系。
　　3、心理應(yīng)激能夠引起三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，且阻斷二者的活化均能夠緩解咬肌區(qū)痛覺敏感，同時(shí)分別下調(diào)對(duì)方的活性，說明，在心理應(yīng)激致大鼠咬肌區(qū)痛覺敏感的過程中，神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞二者相互作用，促進(jìn)咬肌區(qū)痛覺敏感的發(fā)生發(fā)展。
　　4、心理應(yīng)激后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK明顯活化并參與心理應(yīng)激誘導(dǎo)的咬肌區(qū)痛覺敏感；神經(jīng)元上的NMDA受體以細(xì)胞間的間