低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織鋅指蛋白A20的變化及NF-κB的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension, PAH)是一種診斷相對困難、愈后較差的肺部疾病，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。低氧性肺動脈高壓是WHO關(guān)于肺動脈高壓五大分類中的第三類肺動脈高壓，低氧可導(dǎo)致肺動脈血管壁重構(gòu)，使血管壁增厚，管腔狹窄，導(dǎo)致肺動脈高壓及肺源性心臟病，其中血管重構(gòu)最主要的病理改變是肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖。肺動脈高壓的形成與NF-κB信號通路的激活密切相關(guān)。而NF-κB被激活后，一方面可誘導(dǎo)大

2、量炎癥介質(zhì)的釋放，另一方面，還可引起肺動脈血管出現(xiàn)增殖和凋亡異常。因此，深入探討NF-κB是如何參與調(diào)控低氧性肺動脈高壓的形成，從而減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及維持肺動脈血管的穩(wěn)定，己成為當(dāng)前研究領(lǐng)域的重要課題。為解決本課題所提出的問題，擬構(gòu)建低氧性肺動脈高壓的大鼠模型，采用Western Blot的方法檢測正常組和低氧組大鼠肺組織中NF-κB相關(guān)蛋白、A20、HIF1、NOD2、PCNA、PKA、PKC、ERK、Akt、iNOS等蛋白表

3、達(dá)水平的變化；以及給予PDTC處理抑制NF-κB后，檢測大鼠肺組織中NF-κB相關(guān)蛋白、A20蛋白、HIF1α、NOD2、PCNA、PKA、PKC、ERK、Akt等蛋白表達(dá)水平的變化。本實驗主要是從整體水平探討保護(hù)基因A20在低氧性肺動脈高壓中的表達(dá)水平的變化，并深入探討NF-κB調(diào)控低氧性肺動脈高壓的具體機制是否與調(diào)控A20的表達(dá)有關(guān)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴實驗大鼠培養(yǎng)在常壓低氧艙內(nèi)（O2濃度為9％~11%，CO2濃度＜5

4、%），23小時/天，連續(xù)14天，采用右心導(dǎo)管法檢測平均肺動脈壓（mPAH）、右心肥大指數(shù)RV/(LV+S)）的變化，結(jié)果顯示mPAH和 RV/(LV+S)）顯著升高，這些結(jié)果表明PAH大鼠動物模型造模成功。⑵Western Blot結(jié)果顯示，與正常組相比，低氧組大鼠的肺組織中NF-κB亞型P65胞核蛋白表達(dá)水平顯著升高，而胞漿P65表達(dá)水平顯著降低；A20的蛋白表達(dá)水平顯著降低；細(xì)胞增殖標(biāo)志性蛋白PCNA和HIF1的蛋白的表達(dá)水平顯著增

5、加。另外我們也檢測了相關(guān)信號通路中的信號分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，低氧組與正常組相比，大鼠肺組織中p-ERK、NOD2蛋白表達(dá)水平顯著增加， p-PKA、p-PKC、p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低，而 iNOS、PKA、PKC、ERK、Akt蛋白表達(dá)水平無明顯變化。表明低氧激活NF-kB信號通路誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肺動脈高壓，可能是通過抑制A20的表達(dá)，增強大鼠肺組織細(xì)胞膜上ERK、NOD2的活性，降低PKA、PKC、Akt的活性實現(xiàn)的。⑶用Rea

6、l-time PCR方法檢測不同低氧時間段，大鼠肺組織中A20基因和NF-κB基因的表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，低氧3d組大鼠肺組織中A20和NF-κB基因的表達(dá)沒有明顯的變化；低氧7d組大鼠與正常組相比，A20和NF-κB的基因明顯增高；低氧14d組大鼠與正常組相比，A20基因顯著降低， NF-κB的基因表達(dá)水平增高。表明NF-κB可刺激A20的表達(dá)，而A20可負(fù)反饋調(diào)控NF-κB的活性。⑷在肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）

7、中，低氧48h時，A20的表達(dá)水平明顯降低。同時用CCK8的試驗方法檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低氧24h或48h時細(xì)胞的增殖率與正常組相比明顯增高。表明低氧條件下， PASMC的增殖可能與A20表達(dá)水平的降低有關(guān)。⑸為了進(jìn)一步論證NF-κB調(diào)控低氧性肺動脈高壓是否與NF-κB調(diào)控A20有關(guān)。皮下注射NF-κB拮抗劑PDTC，檢測大鼠肺組織中A20的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Hypoxia組大鼠相比，Hypoxia+PDTC組大鼠的mPAH和R

8、V/(LV+S)）顯著降低，表明抑制NF-κB后對大鼠的肺動脈壓力和心功能失調(diào)有明顯的緩解作用，同時還發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織中A20的表達(dá)水平明顯增加，增殖標(biāo)志性蛋白PCNA明顯降低， p-ERK、NOD2蛋白表達(dá)水平顯著降低， p-PKA、p-PKC、p-Akt蛋白表達(dá)顯著增加， iNOS、PKA、PKC、ERK、Akt蛋白表達(dá)水平無明顯變化。表明NF-κB調(diào)控低氧性肺動脈高壓可能是與NF-κB對A20的負(fù)性調(diào)控，抑制PKA、PKC、Akt信