“抗栓一號”基于Sirt1-TLR4-NF-κB炎癥通路對內皮損傷的保護作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　以維生素（VitaminD3 VD3）腹腔注射結合高脂飲食誘導的內皮損傷大鼠模型為研究對象，觀察“抗栓一號”（紅花、水蛭、蘇木）中藥復方對高脂誘導的內皮損傷的保護作用。觀察“抗栓一號”中藥復方在改善大鼠動物模型血脂水平的功效;觀察“抗栓一號”中藥復方對多種炎癥因子的調控能力;并對“抗栓一號”發(fā)揮抗炎作用改善內皮損傷的作用機制進行了探討。
　　方法:
　　(1)利用高效液相色譜法(HPLC)對“抗栓一號”復方

2、進行有效成分的分析;
　　(2)動物實驗:參照腹腔注射VD3聯(lián)合高脂飼料的造模方法進行內皮損傷的造模。所有的大鼠首先用普通飼料適應性飼養(yǎng)1周，1周后除空白組外開始以上述的造模方法進行造模。第一次腹腔注射給予VD360萬U·kg-1，然后在第3、6、9周時各補充VD310萬U·kg-1，使用預先配制好的高脂飼料進行造模喂養(yǎng)，持續(xù)9周。將60只SD模型大鼠，隨機分為:中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，陽性藥物組（瑞舒伐他汀），聯(lián)合用藥

3、組（陽性藥組+中藥中劑量），模型組，另有10只SD大鼠為空白對照組，計7組。觀察主動脈內皮HE染色結果，檢測生化指標血清總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ELISA法測白介素1β(IL-1β)，白介素6(IL-6)，白介素12(IL-12)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，免疫組化法檢測白介素1β(IL-1β)，白介素6（IL-6），白介素12(IL-12)，腫瘤

4、壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的表達水平;利用Western Blot和realtime-PCR方法對“抗栓一號”抗炎作用機制的研究，證實Sirt1/TLR4/NF-κB信號通路的可行性。
　　(3)細胞實驗:參照相關文獻，使用HUVEC細胞，利用ox-LDL進行誘導構造HUVEC損傷模型。取傳至5-7代的HUVEC細胞，預培養(yǎng)后給予不同濃度ox-LDL(10ug/ml～160ug/ml)，通過CCK8檢測法觀察ox-LDL對

5、HUVEC增殖的抑制情況，確定ox-LDL的誘導的濃度;對5～7代的HUVEC先進行饑餓培養(yǎng)，再給予不同濃度的“抗栓一號”含藥血清（終濃度5％、10％、20％、40％），同樣利用CCK8法來觀察“抗栓一號”含藥血清對HUVEC的增殖影響與細胞毒性，來確定“抗栓一號”含藥血清的干預濃度。將細胞分為空白組、對照組、含藥血清低濃度組、含藥血清中濃度組、以及含藥血清高濃度組進行培養(yǎng);在細胞ELISA實驗中，提取細胞上清來檢測白介素1β（IL-1

6、β），白介素6(IL-6)，白介素12(IL-12)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)的指標;提取各組細胞的蛋白，利用Western Blot實驗方法對Sirt1/TLR4/NF-κB信號通路進行進一步驗證;以含藥血清（終濃度10％）為干預濃度，同時給予Sirt1蛋白抑制劑和TLR4蛋白抑制劑，利用Western Blot實驗方法觀察當上游基因Sirt1受到抑制與中游的TLR4蛋白收到抑制時，Sirt1/TLR4/NF-κB信號通路中各蛋白

7、的表達情況，明確信號通路的正確性。
　　結果:
　　(1)高效液相分析:按照高效液相色譜法的實驗步驟，從標準品中分離發(fā)現(xiàn)了:1.尿嘧啶核苷;2.次黃嘌呤核苷;3.鳥嘌呤核苷;4.紅花黃色素A;5.巴西蘇木素。
　　(2)動物實驗:
　?、賁D大鼠經9周造模后，出現(xiàn)高脂誘導的內皮損傷表現(xiàn)，通過對大鼠的胸主動脈進行HE染色。染色結果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的胸主動脈出現(xiàn)了血管內膜的不光滑，觀察到內皮細胞排列紊亂，而且連續(xù)性較差

8、，內皮細胞間及皮膜下出現(xiàn)了泡沫細胞的大量蓄積，同時血管平滑肌細胞也變現(xiàn)有增生的改變;此外，通過記錄觀察到模型組大鼠的體重與空白組相比有明顯地降低;
　　②HE染色結果:成模大鼠經過藥物灌胃治療后，HE染色結果顯示，中藥各劑量組、陽性藥物組以及聯(lián)合用藥組的血管內膜與模型組相比，內膜的染色結果有較大改善，相對排列規(guī)整，內膜相對光滑，僅產生少量泡沫細胞的蓄積和平滑肌增生;
　　③血脂水平:與空白組相比，模型組血脂水平TC、TG、L

9、DL均提高，HDL降低，且具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，各干預組與模型組相比，除低劑量組外，高、中劑量組、陽性藥組、聯(lián)合用藥組與模型組相比，TC均有顯著下降，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，低劑量組與模型組相比，TC下降趨勢較低，但仍具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);TG下降程度與TC各組相當，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01，p＜0.05)，各干預組與模型組相比，LDL-c均下降且具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01，p＜0.05)，中藥各干預組

10、與模型組相比，高劑量組與中劑量組對HDL-c的改善與模型相比有統(tǒng)計學意義(p＜0.01與p＜0.05)，低劑量組與模型組相比無明顯差異(p＞0.05);
　?、苎装Y因子水平:免疫組化實驗結果提示:與空白組相比，模型組IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平均提高，而各干預組與模型組相比，炎癥因子的表達均下降;ELISA實驗方法對血清中的炎癥因子水平進行了測定，實驗結果提示與空白組，模型組IL-1β，IL-6，IL-12，T

11、NF-α水平均提高，且具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，而各干預組與模型組相比，炎癥因子均下降，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);
　　⑤Sirt1/TLR4/NF-κB信號通路實驗結果:通過WB和RT-PCR實驗方法，實驗結果表明模型組的Sirt1蛋白水平與空白組相比顯著降低(p＜0.01)，TLR4和NF-κB顯著上調(p＜0.01)，在經過各中藥干預組干預后結果顯示，中藥干預后Sirt1蛋白的表達水平升高，TLR4和NF-κB下

12、降(p＜0.01或p＜0.05)，且調整水平與中藥干預劑量呈相關性。PCR結果提示，模型組大鼠的Sirt1表達與空白組相比也有明顯降低(p＜0.01)，TLR4和NF-κB表達明顯升高(p＜0.01)，中藥干預后的結果與WB結果一致。
　　細胞實驗:
　?、賝x-LDL與“抗栓一號”含藥血清干預濃度:
　　1.在相在相同的藥物處理時間下，隨著ox-LDL濃度的增加，HUVEC細胞的相對活力逐漸減少，ox-LDL對原代H

13、UVEC細胞增殖的抑制率越大，而且抑制效果呈劑量依賴性。干預24小時后，發(fā)現(xiàn)80μg/mL濃度的ox-LDL對HUVEC細胞產生抑制增殖的作用，HUVEC細胞的相對活力明顯降低(p＜0.05)。最終使用80μg/mL濃度的ox-LDL干預HUVEC細胞，來進行相關作用與機制的研究。
　　2.相同的藥物處理時間下，實驗結果發(fā)現(xiàn)，隨著含藥血清濃度的增加，HUVEC細胞的生長情況更好，而且呈劑量依賴性。而HUVEC細胞在經過40％濃度的

14、含藥血清處理后的存活率與20％的濃度出現(xiàn)差異(p＜0.05)。最終選用含藥血清濃度終濃度5％、10％、20％的三個給藥劑量，以此三種濃度的含藥血清進行干預，來研究對ox-LDL誘導的HUVEC細胞損傷的作用與作用機制。
　　②炎癥因子水平:ELISA實驗方法對細胞上清中的炎癥因子水平進行了實驗，實驗結果提示與空白組相比，ox-LDL干預組IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平均提高，且具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，而含

15、藥血清干預組與ox-LDL干預組相比，炎癥因子均下降，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，且與濃度呈相關性;
　?、跾irt1/TLR4/NF-κB信號通路實驗結果:
　　與空白對照組相比，ox-LDL干預組的Sirt1蛋白水平明顯下調，TLR4、NF-κB蛋白水平明顯上調，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);經過“抗栓一號”含藥血清干預后，Sirt1蛋白水平出現(xiàn)明顯升高，相應的，TLR4、NF-κB蛋白水平明顯下調，且蛋白的調整水

16、平與含藥血清干預的濃度有相關性，其中10％與20％濃度的含藥血清對蛋白的調整與模型組相比，下調具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，5％濃度的含藥血清對蛋白的調整與模型組相比，調整趨勢較低(p＜0.05);
　　加入Sirt1蛋白抑制劑后，“抗栓一號”含藥血清干預ox-LDL誘導的HUVEC引起的Sirt1上調程度與未加蛋白抑制劑相比，Sirt1上調程度有明顯差異(p＜0.01);同時TLR4與NF-κB的蛋白表達兩組間也有明顯差異(p

17、＜0.01，p＜0.05);
　　加入TLR4蛋白抑制劑后，“抗栓一號”含藥血清干預ox-LDL誘導的HUVEC引起的TLR4下調調程度與未加蛋白抑制劑相比，TLR4下調程度有明顯差異(p＜0.01);此外，而NF-κB的蛋白表達兩組之間也有明顯差異(p＜0.05)，Sirt1蛋白表達兩組間而無明顯差異。
　　結論:
　　(1)高效液相色譜法可以用來進行中藥復方制劑有效成分的分析;
　　(2)給予SD大鼠腹腔注射

18、VD3聯(lián)合高脂飲食可以用來作為內皮損傷動物模型的造模方法;
　　(3)“抗栓一號”中藥復方可以改善高脂誘導內皮損傷大鼠血清中的血脂水平，降低TC、TG、LDL-c，升高HDL-c來緩解內皮損傷;
　　(4)“抗栓一號”中藥復方可以下調高脂誘導內皮損傷大鼠血清與ox-LDL誘導的HUVEC細胞上清中的IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平，降低大鼠胸主動脈中的IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平的表達，起