IL-17與黏附侵襲性大腸桿菌LF82在炎癥性腸病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　克羅恩?。–rohn’s disease，CD）與潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）被稱為炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD），病變遍及全消化道，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，極大的阻礙了其徹底治愈，開展相關(guān)研究，將為我國IBD的發(fā)病機(jī)制研究、臨床診斷和治療提供服務(wù)，具有重要的科學(xué)意義。其病因不明，現(xiàn)普遍認(rèn)為IBD是遺傳易感個體對腸腔內(nèi)容物（如細(xì)菌、食物）的不恰當(dāng)

2、免疫反應(yīng)的結(jié)果。除了腸道微生態(tài)的失衡以外，大腸桿菌在 IBD的發(fā)病中起重要作用。黏附侵襲性大腸桿菌（adherent-invasive Escherichia coli，AIEC）為最受關(guān)注的IBD可能致病菌之一。在IBD發(fā)生發(fā)展的過程中AIEC是否參與猶未可知。近年發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞參與炎癥性腸?。↖BD）等多種自身免疫性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，其分泌的IL-17在其中起關(guān)鍵作用。然而IL-17對IBD似乎起致病和保護(hù)的雙重作用，其中的

3、機(jī)制仍未闡明。缺乏IL-17的個體感染AIEC會產(chǎn)生何種結(jié)果，AIEC是否可通過Th17細(xì)胞加重IBD尚不清楚。本研究旨在明確模式動物及相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示Th17細(xì)胞的分化調(diào)控在AIEC加重的腸道炎癥中的作用和機(jī)制，項(xiàng)目的開展將有助于明確IBD的發(fā)病機(jī)制，具有重要科學(xué)意義。
　　方法：
　　1.向C57BL/6J野生小鼠灌胃，連續(xù)十天給予1×109CFU/天E.coli LF82，觀察E.coli LF82對結(jié)腸上皮屏障完整

4、性的影響。通過HE染色觀察小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)改變；通過通過透射電鏡和掃描電鏡觀察小鼠結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化；通過ELISA研究E.coli LF82對小鼠結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子的影響;通過免疫組織化學(xué)和PCR檢測實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸內(nèi)的IL-17表達(dá)，檢驗(yàn)E.coli LF82是否引起IL-17的變化。同樣對IL-17敲除鼠給予連續(xù)十天1×109CFU/天E.coli LF82。觀察E.coli LF82對結(jié)腸上皮屏障完整性的影響。通過通過透

5、射電鏡和掃描電鏡觀察小鼠結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化；通過HE染色觀察小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)改變；通過ELISA研究E.coli LF82定植后小鼠結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子的變化，探討IL-17在E.coli LF82對小鼠結(jié)腸黏附侵襲中的作用。
　　2.建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，給予實(shí)驗(yàn)動物1×109CFU/天E.coli LF82灌胃十天，然后用3％ DSS造小鼠結(jié)腸炎模型，通過體重和小鼠結(jié)腸長度、HE病理組織學(xué)表現(xiàn)三個方面來研究E.col

6、i LF82對結(jié)腸炎癥的影響作用。通過Bio-plex測定結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的變化，通過免疫組織化學(xué)和PCR檢測實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸內(nèi)的IL-17表達(dá)證實(shí)IL-17是否影響E.coli LF82的對結(jié)腸炎的影響。
　　3.IL-17基因敲除小鼠也建立同樣的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型。通過體重和小鼠結(jié)腸長度、HE病理組織學(xué)表現(xiàn)比較腸道定植了E.coli LF82以后野生型小鼠和IL-17基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的炎癥程度，探討IL-17是否影響定

7、植了E.coli LF82的小鼠結(jié)腸炎。通過Bio-plex測定IL-17基因敲除小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)果：
　　1.通過HE染色的病理切片發(fā)現(xiàn)定植的E.coli LF82可導(dǎo)致野生型小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞輕微紊亂和炎性細(xì)胞浸潤明顯，接下來通過PCR和免疫組化發(fā)現(xiàn)定植了E.coli LF82的野生型小鼠的結(jié)腸組織中IL-17的分泌量升高。相比定植了E.coli LF82的野生型小鼠，IL-17敲除鼠定植E.co

8、li LF82后結(jié)腸上皮細(xì)胞更紊亂，炎性細(xì)胞浸潤也更加明顯。透射電鏡顯示定植E.coli LF82以后，野生型小鼠腸上皮細(xì)胞微絨毛排列有序，而IL-17敲除鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛大量脫落。進(jìn)一步通過透射電鏡和掃描電鏡研究發(fā)現(xiàn)在IL-17敲除鼠的結(jié)腸組織中，E.coli LF82不僅損傷結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛，還以胞吞的方式侵襲到結(jié)腸上皮細(xì)胞，而野生型小鼠則沒有觀察到以上現(xiàn)象。
　　2.通過體重和小鼠結(jié)腸長度指標(biāo)評價發(fā)現(xiàn)E.coli LF

9、82對DSS誘導(dǎo)野生型小鼠結(jié)腸炎癥炎癥程度并無影響，小鼠結(jié)腸組織學(xué)評分也沒有差別。在DSS誘導(dǎo)野生型小鼠結(jié)腸炎癥中，PCR和免疫組化發(fā)現(xiàn)E.coli LF82使結(jié)腸中IL-17含量升高。接著通過急性活動相關(guān)性和組織學(xué)評分發(fā)現(xiàn)，在IL-17敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中E.coli LF82加重了DSS誘導(dǎo)IL-17敲除小鼠的結(jié)腸炎癥；相比定植E.coli LF82對野生型小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癥的影響，E.coli LF82明顯加重了IL-17敲除

10、小鼠的DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥程度。
　　3.此外通過檢測結(jié)腸組織炎癥因子發(fā)現(xiàn)，在普通腸道相比野生型小鼠，E.coli LF82的定植使 IL-17敲除小鼠結(jié)腸中IL-22的分泌降低。在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中，E.coli LF82可進(jìn)一步降低DSS誘導(dǎo)IL-17敲除小鼠結(jié)腸中IL-22的分泌釋放。說明IL-17能夠促進(jìn)IL-22分泌。
　　結(jié)論：
　　我們的研究證實(shí)E.coli LF82可引起小鼠結(jié)腸炎癥，定植了E.coli

11、LF82的野生型小鼠的結(jié)腸組織中IL-17的分泌量升高。在IL-17缺乏時，E.coli LF82可進(jìn)一步破壞小鼠腸上皮屏障完整性。在DSS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性野生型小鼠結(jié)腸炎中，E.coli LF82也可刺激小鼠結(jié)腸IL-17分泌增加；而在IL-17敲除小鼠中，E.coli LF82也可加重DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥，表明在IL-17缺乏時，E.coli LF82可加重炎癥；在定植了E.coli LF82后，與野生型小鼠小鼠相比，IL-17敲除小