RhoA-ROCK信號(hào)通路在青霉素和雙黃連注射液類過敏反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、目的
　　研究兩種代表性注射劑青霉素注射液和雙黃連注射液的過敏樣反應(yīng)特點(diǎn)，探討其導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增加的機(jī)理，闡明RhoA/ROCK信號(hào)通路在青霉素和雙黃連注射液致類過敏反應(yīng)中所起到的作用。此外，明確雙黃連注射液導(dǎo)致類過敏反應(yīng)的主要成分。
　　方法
　　1、青霉素注射液過敏樣反應(yīng)特點(diǎn)
　　(1) ICR小鼠腹腔注射6.25、25或100萬單位·kg-1青霉素鈉（氫氧化鋁為佐劑）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏

2、小鼠和未致敏小鼠分別一次性尾靜脈注射3.125、12.5或50萬單位·kg-1青霉素鈉和伊文思藍(lán)(EB)的混合液。給藥30min后，以小鼠耳廓藍(lán)染面積評(píng)分和耳組織EB滲出量為指標(biāo)，分別觀察青霉素注射液引起小鼠過敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射青霉素鈉致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。將血清注射到空白小鼠背部皮膚使其被動(dòng)致敏，2h后對(duì)小鼠一次性尾靜脈注射3.125、12.5或50萬單位·kg-1青霉

3、素鈉和EB的混合液。30min后，觀察接受血清小鼠皮膚內(nèi)側(cè)藍(lán)斑情況。
　　(3) ICR小鼠一次性尾靜脈注射12.5、25或50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥30min后處死動(dòng)物，用打耳器打下耳片稱重，同時(shí)取耳和肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。
　　2、雙黃連注射液過敏樣反應(yīng)特點(diǎn)
　　(1) ICR小鼠腹腔注射300mg·kg-1雙黃連（氫氧化鋁為佐劑）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1

4、雙黃連和EB的混合液。給藥30min后，以小鼠耳廓藍(lán)染面積評(píng)分和耳組織EB滲出量為指標(biāo)，分別觀察雙黃連注射液引起小鼠過敏反應(yīng)和類過敏反應(yīng)的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射雙黃連注射液致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。將血清注射到空白小鼠背部皮膚使其被動(dòng)致敏，2h后對(duì)小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液。給藥30min后，觀察接受血清小鼠皮膚內(nèi)側(cè)藍(lán)斑情況。
　　(3) ICR小鼠一次性尾靜

5、脈注射150、300或600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液，給藥30min后對(duì)小鼠耳廓藍(lán)染面積進(jìn)行評(píng)分，用打耳器打下耳片稱重，定量測(cè)定耳組織EB滲出量，并取耳、肺、腸組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。
　　3、青霉素注射液類過敏反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制
　　(1)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響:采用Transwell小室將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)培養(yǎng)成體外血管內(nèi)皮細(xì)胞單層，加入0.125、0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液與血管內(nèi)皮

6、細(xì)胞單層孵育1h后，檢測(cè)FITC-葡聚糖透過細(xì)胞單層的情況。
　　(2)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響:采用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)HUVECs，加入0.125、0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液孵育1h，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞F-actin染色，觀察細(xì)胞骨架的變化。
　　(3)對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.5萬單位·mL-1青霉素注射液孵育5、15、30、60min，收集細(xì)胞。采用Wes

7、tern-blot方法檢測(cè)細(xì)胞GTP-RhoA（GTP-RhoA/RhoA％）、p-MYPT1(p-MYPT1/MYPT1％)和p-MLC2(p-MLC2/MLC2％)蛋白的表達(dá)。另外，小鼠一次性尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥15、30、60、120min后取耳和肺組織，采用Western-blot方法檢測(cè)組織中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達(dá)。
　　(4) ROCK抑制劑對(duì)青霉素注射液作用的

8、影響:在培養(yǎng)的HUVECs或細(xì)胞單層中加入鹽酸法舒地爾預(yù)先處理后，加入青霉素注射液，按照上述同樣方法檢測(cè)p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)變化、血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架變化以及細(xì)胞單層FITC-葡聚糖透過情況。此外，小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥后15min和30min分別取耳和肺組織檢測(cè)p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)變化情況。小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素

9、鈉和EB的混合液，30min后進(jìn)行耳廓藍(lán)染面積、耳組織EB滲出量、耳片重量、耳和肺組織病理學(xué)等檢查。
　　4、雙黃連注射液類過敏反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制
　　(1)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響:采用Transwell小室培養(yǎng)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞單層，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液與血管內(nèi)皮細(xì)胞單層孵育1h后，檢測(cè)FITC-葡聚糖透過細(xì)胞單層的情況。
　　(2)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響:采用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)H

10、UVECs，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液孵育1h，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞F-actin染色，觀察細(xì)胞骨架的變化。
　　(3)對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.15mg·mL-1雙黃連注射液孵育15、30、60、120min，收集細(xì)胞。采用Western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達(dá)。另外，小鼠一次性尾靜脈注射60

11、0mg·kg-1雙黃連注射液，給藥15、30、60、120min后取耳、肺和腸組織，采用Westem-blot方法檢測(cè)組織中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達(dá)。
　　(4) ROCK抑制劑對(duì)雙黃連注射液作用的影響:在培養(yǎng)的HUVECs或細(xì)胞單層中加入鹽酸法舒地爾預(yù)先處理后，加入雙黃連注射液，按照上述同樣方法檢測(cè)p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)變化、血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架變化、以及細(xì)胞單層FITC-葡聚糖透過情況。此

12、外，小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連，給藥后30min分別取耳、肺和腸組織檢測(cè)p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)變化情況。小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液，30min后進(jìn)行耳廓藍(lán)染面積、耳組織EB滲出量、耳片重量、耳、肺和腸組織病理學(xué)等檢查。
　　5連翹酯苷類成分的類過敏反應(yīng)及其致類過敏機(jī)制研究
　　(1)類過敏反應(yīng)研究:采用Transw

13、ell小室培養(yǎng)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞單層，分別加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A、B或E孵育1h后，檢測(cè)FITC-葡聚糖透過細(xì)胞單層的情況。采用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)HUVECs，加入上述濃度的連翹酯苷A、B或E孵育1h，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞F-actin染色，觀察其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響。另外，小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1連翹酯苷A、B或E，給藥30min后觀察耳廓藍(lán)染面積，定量測(cè)定耳組織EB滲出量，以評(píng)價(jià)

14、體內(nèi)類過敏反應(yīng)。
　　(2)類過敏機(jī)制研究:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.05、0.1或0.15 mg·mL-1連翹酯苷A、B或E，收集細(xì)胞。采用Western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達(dá)。在培養(yǎng)的HUVECs或細(xì)胞單層中加入鹽酸法舒地爾預(yù)先處理后，加入連翹酯苷A或B，按照上述同樣方法檢測(cè)p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)變化、血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架變化、以及細(xì)胞單層FITC-葡聚糖

15、透過情況。
　　結(jié)果
　　1、青霉素注射液致小鼠類過敏反應(yīng)
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在靜脈注射給予青霉素鈉后，均出現(xiàn)類似的耳藍(lán)染反應(yīng)，這種反應(yīng)與青霉素劑量成正相關(guān)，與致敏無關(guān)。PCA試驗(yàn)顯示青霉素注射液不能誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，因此青霉素注射液誘導(dǎo)的上述反應(yīng)不是IgE介導(dǎo)的，可能是類過敏反應(yīng)。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，青霉素鈉單次靜脈注射后，小鼠的耳和肺組織出現(xiàn)劑量相關(guān)的水腫和炎癥反應(yīng)，提示青霉素注射液可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生以血管滲出增加

16、和炎癥反應(yīng)為特征的類過敏反應(yīng)。
　　2、雙黃連注射液致小鼠類過敏反應(yīng)
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在靜脈注射給予雙黃連后，均出現(xiàn)類似的耳藍(lán)染反應(yīng)，這種反應(yīng)與致敏無關(guān)。PCA試驗(yàn)顯示雙黃連注射液不能誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，因此雙黃連注射液誘導(dǎo)的上述反應(yīng)不是IgE介導(dǎo)的，可能是類過敏反應(yīng)。此外，雙黃連注射液所導(dǎo)致的耳藍(lán)染反應(yīng)與給藥劑量正相關(guān)。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，雙黃連單次靜脈注射后，小鼠的耳、肺和腸組織出現(xiàn)劑量相關(guān)的水腫和炎癥反應(yīng)。結(jié)果提示

17、，雙黃連注射液可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生以血管滲出增加和炎癥反應(yīng)為特征的類過敏反應(yīng)。
　　3、RhoA/ROCK信號(hào)通路參與青霉素注射液的類過敏反應(yīng)
　　在體外試驗(yàn)中，0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液可導(dǎo)致HUVECs肌動(dòng)蛋白明顯聚集和重組以及血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性顯著增加，反應(yīng)與濃度相關(guān)。0.5萬單位·mL-1青霉素注射液可導(dǎo)致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2表達(dá)增加，以加藥后15-30min作用最為

18、明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。采用法舒地爾預(yù)處理可以明顯改善青霉素注射液誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加和細(xì)胞骨架變化。在體內(nèi)試驗(yàn)中，小鼠一次性尾靜脈注射給予50萬單位·kg-1青霉素鈉會(huì)導(dǎo)致耳和肺組織GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達(dá)增加，蛋白上調(diào)一般在給藥后15-30min最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。預(yù)先給予法舒地爾可以抑制青霉素注射液所引發(fā)的血管滲出增加和炎癥反應(yīng)。結(jié)果提示，RhoA/ROCK信號(hào)通路激活是誘導(dǎo)青霉

19、素注射液類過敏反應(yīng)的重要機(jī)制之一。
　　4、RhoA/ROCK信號(hào)通路參與雙黃連注射液的類過敏反應(yīng)
　　在體外試驗(yàn)中，0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液可導(dǎo)致HUVECs肌動(dòng)蛋白聚集和重組以及血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加，反應(yīng)與濃度有一定相關(guān)性。0.15mg·mL-1雙黃連注射液可導(dǎo)致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達(dá)增加，以加藥后15-30 min作用最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。采用

20、法舒地爾預(yù)處理可以改善雙黃連注射液誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加和細(xì)胞骨架變化。在體內(nèi)試驗(yàn)中，小鼠一次性尾靜脈注射給予600mg·kg-1雙黃連會(huì)導(dǎo)致耳、肺、腸組織GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達(dá)增加，蛋白上調(diào)一般在給藥后15-60min最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。預(yù)先給予法舒地爾可以抑制雙黃連注射液所引發(fā)的血管滲出增加和炎癥反應(yīng)。結(jié)果提示，RhoA/ROCK信號(hào)通路激活是誘導(dǎo)雙黃連注射液類過敏反應(yīng)的重要機(jī)制之一

21、。
　　5、RhoA/ROCK信號(hào)通路參與連翹酯苷的類過敏反應(yīng)
　　在體外試驗(yàn)中，0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A和連翹酯苷B可導(dǎo)致HUVECs單層通透性明顯增加，而連翹酯苷E對(duì)細(xì)胞單層通透性影響較小。與通透性結(jié)果一致，0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A和連翹酯苷B可誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞骨架變化，而連翹酯苷E的作用相對(duì)較弱。連翹酯苷A和連翹酯苷B可導(dǎo)致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2

22、的表達(dá)呈濃度相關(guān)性增加，其中連翹酯苷A的作用強(qiáng)于連翹酯苷B，而連翹酯苷E則對(duì)蛋白的表達(dá)幾乎沒有影響。給予法舒地爾可以明顯抑制連翹酯苷A和連翹酯苷B誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性增加和細(xì)胞骨架變化。通過體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷A和連翹酯苷B可引起小鼠血管滲出增加，而連翹酯苷E則未見該作用。結(jié)果提示，連翹酯苷通過激活RhoA/ROCK信號(hào)通路誘發(fā)動(dòng)物類過敏反應(yīng)的作用與化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　結(jié)論
　　1、青霉素和雙黃連注射液

23、均可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)以血管滲出增加和炎癥反應(yīng)為特征的類過敏反應(yīng);未誘導(dǎo)IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。二者所致的類過敏反應(yīng)均具有劑量相關(guān)性，提示臨床上控制劑量可能降低該不良反應(yīng)。
　　2、RhoA/ROCK信號(hào)通路激活，從而產(chǎn)生血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架調(diào)整，致使血管通透性增高，是青霉素和雙黃連注射液類過敏反應(yīng)的重要機(jī)制之一。
　　3、連翹酯苷類成分是雙黃連注射液的主要致類過敏成分之一，但不同的連翹酯苷引起的反應(yīng)強(qiáng)度差別較大。其中，連翹酯苷A誘發(fā)的