雙黃連注射液致敏反應(yīng)特征及致敏標(biāo)志物研究.pdf

1、中藥注射劑是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有價(jià)格低廉、療效顯著等優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)今全國(guó)有400多家企業(yè)生產(chǎn)已有批準(zhǔn)文號(hào)的109種中藥注射劑，年銷售額超過(guò)200億元，年使用量超過(guò)4億人次。
　　中藥注射劑由于其成分和制造工藝等方面的復(fù)雜性，近年來(lái)隨著臨床上的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了一系列以過(guò)敏反應(yīng)為代表的不良反應(yīng)。雙黃連注射液（Shuanghuanglian Injection）由金銀花、黃芩、連翹3味中藥的提取物配制而成，具有清熱解毒

2、的功效和抗菌抗病毒的藥理作用，臨床上用于治療上呼吸道感染等炎癥的療效較好，使用非常廣泛。不容忽視的是隨著使用量的增加，雙黃連注射液的不良反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。雙黃連注射液自2002年上市后，先后2次由于嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生在2001年11月第1期和2009年5月第22期由國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心發(fā)布的《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》中被采取管制措施。雙黃連注射液為中藥注射劑大品種，在多篇研究報(bào)道中都可以看到其居于中藥注射劑不良反應(yīng)首位，以雙黃連注射

3、液為例進(jìn)行研究具有代表性及現(xiàn)實(shí)意義。本研究以雙黃連注射液為研究對(duì)象，對(duì)其體內(nèi)、體外致敏特征和體內(nèi)致敏標(biāo)志物分別進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究:
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 雙黃連注射液致敏特征體內(nèi)研究
　　目的：明確雙黃連注射液過(guò)敏類型，研究其體內(nèi)致敏特征。
　　方法：選用雌性，體質(zhì)量18～20 g的Balb/c小鼠。依照如下研究方法進(jìn)行給藥和觀察。
　?、裥瓦^(guò)敏反應(yīng)，采用主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)(ASA

4、)的方法，設(shè)定空白組、陽(yáng)性藥卵清蛋白(OVA)組和雙黃連注射液臨床劑量組，研究藥物激發(fā)后小鼠全身過(guò)敏癥狀和全身皮膚血管通透性變化。
　　類過(guò)敏反應(yīng)，根據(jù)雙黃連注射液的臨床給藥方式（一次性靜脈給藥），以臨床劑量為中心設(shè)置5個(gè)梯度給藥劑量（以雙黃連注射液生藥量1g·m1-1為換算基礎(chǔ)）即雙黃連注射液5，10，20，40，60g·kg-1（相當(dāng)于臨床劑量0.5、1倍、2倍、4倍和6倍），觀察給藥60min內(nèi)小鼠全身和局部的過(guò)敏癥狀、血清

5、IgE、組胺含量變化、腸壁及腸系膜、皮膚血管通透性的改變等指標(biāo)。
　　結(jié)果：主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)(ASA)的方法給藥后，雙黃連注射液組小鼠全身過(guò)敏癥狀評(píng)分結(jié)果為陰性，皮膚血管通透性未見(jiàn)明顯變化。雙黃連注射液一次性靜脈給藥后，高劑量（雙黃連注射液40，60g·kg-1）組在給藥短時(shí)間內(nèi)小鼠即出現(xiàn)呼吸困難、眼眶水腫、眼角分泌物持續(xù)增多等嚴(yán)重過(guò)敏癥狀，與空白組比較腸壁及腸系膜、皮膚血管通透性均增加。各給藥組小鼠血清IgE含量未發(fā)生顯著性變化

6、，血清組胺含量顯著性升高。
　　結(jié)論：雙黃連注射液的臨床常見(jiàn)過(guò)敏類型為類過(guò)敏反應(yīng)，這種過(guò)敏反應(yīng)在首次給藥后短時(shí)間內(nèi)即可發(fā)生。
　　第二部分 雙黃連注射液致敏標(biāo)志物的研究
　　目的：對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)響應(yīng)雙黃連注射液促成過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的可疑蛋白進(jìn)行篩選。
　　方法：依照雙黃連注射液體內(nèi)致敏特征研究中類過(guò)敏模型的制作方法準(zhǔn)備待檢動(dòng)物血清，將各給藥組和空白組小鼠血清中蛋白成分進(jìn)行聚類分析，利用TMT化學(xué)標(biāo)記方法，Q-Exat

7、ive液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)對(duì)不同雙黃連注射液劑量組的小鼠血清中蛋白成分進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。
　　結(jié)果：聚類分析結(jié)果顯示各給藥組與未給藥組小鼠血清中相似蛋白聚類清晰，易于區(qū)分。共發(fā)現(xiàn)98種蛋白含量相對(duì)變化值＞1.5或＜0.67，且P＜0.05的可疑蛋白，免疫系統(tǒng)和免疫疾病相關(guān)的蛋白數(shù)量最多，共有10個(gè)。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了雙黃連注射液類過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生與免疫系統(tǒng)具有緊密的關(guān)聯(lián)性，體內(nèi)存在對(duì)雙黃連注射液進(jìn)行響應(yīng)并引起類過(guò)敏反應(yīng)的蛋

8、白，為進(jìn)一步確定目標(biāo)蛋白提供了較為可靠的依據(jù)。
　　第三部分 雙黃連注射液致敏特征體外研究
　　目的：研究雙黃連注射液（雙黃連注射液）及其中間品（金銀花連翹提取物、黃芩提取物）的不同濃度對(duì)RBL-2H3細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響，研究雙黃連注射液對(duì)RBL-2H3細(xì)胞凋亡和脫顆粒的影響。
　　方法：將雙黃連注射液以體積比1∶16為初始濃度，按2倍梯度稀釋至1∶4096作為受試樣品。其中間品金銀花、黃芩連翹提取物分別以體積比1∶

9、8為初始濃度，按2倍梯度稀釋至1∶2048作為受試樣品。以各受試樣品分別孵育RBL-2H3細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。應(yīng)用MTT比色法測(cè)定各組RBL-2H3細(xì)胞增殖活力，并計(jì)算細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)。根據(jù)IC50設(shè)置不同給藥濃度，觀察了雙黃連注射液對(duì)RBL-2H3細(xì)胞凋亡的影響，以Compound48/80為陽(yáng)性藥檢測(cè)雙黃連注射液對(duì)RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放的影響情況。
　　結(jié)果：隨著給藥濃度的升高，雙黃連注射

10、液及其中間品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞存活力明顯降低，細(xì)胞損傷逐漸加重，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。隨著雙黃連注射液給藥濃度的升高細(xì)胞凋亡情況逐漸加深，胞外β-氨基己糖苷酶含量降低，并經(jīng)測(cè)算得到雙黃連注射液及中間品的IC50。
　　結(jié)論：高劑量雙黃連注射液對(duì)RBL-2H3細(xì)胞增殖存在一定影響，雙黃連注射液并不能直接促進(jìn)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒。為雙黃連注射液類過(guò)敏細(xì)胞模型的建立、評(píng)價(jià)雙黃連注射液及中間品的安全性及藥物質(zhì)量控制提供