食物致敏性評(píng)價(jià)方法及胡桃蛋白Jugr1致敏性研究.pdf

1、目的： 1.研究BN大鼠作為動(dòng)物致敏模型的可行性，并以此初步建立致敏動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)指標(biāo)，為食品的致敏性評(píng)價(jià)提供手段和方法。 2.研究不同蛋白質(zhì)在體外模擬胃腸消化環(huán)境和熱加工處理環(huán)境中的穩(wěn)定性，以確定模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中的陽性和陰性參考蛋白質(zhì)，并以此建立體外蛋白消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性方法。 3.通過原核表達(dá)系統(tǒng)提取和純化足量的胡桃Jug r 1蛋白，為其致敏性評(píng)價(jià)做好準(zhǔn)備。 4.通過體內(nèi)體

2、外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)Jug r1蛋白的致敏性進(jìn)行初步的研究。 方法： 1.B N大鼠致敏動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)口致敏模型：將30只雌性BN大鼠隨機(jī)分成3組——OVA組、PAP組和陰性對(duì)照組，每組10只，分別灌胃給予1mg/ml的OVA、PAP和生理鹽水，每只每天1 ml，共進(jìn)行42天。腹腔注射致敏模型：40只雌性BN大鼠隨機(jī)分成4組——OVA組、OVA+Al(OH)<,3>組、PAP組和陰性對(duì)照組，每組10只，第1天分別腹腔注射0

3、.1mg/ml的OVA、OVA+免疫佐劑Al(OH)<,3>、PAP和生理鹽水1ml，第5和10天重復(fù)兩次。 各組大鼠于第14、28、42天內(nèi)眥取血離心分離血清用以檢測(cè)特異性IgG和IgE抗體，第21、35天內(nèi)眥取血加入抗凝劑離心分離血漿以檢測(cè)組胺，以之觀察免疫系統(tǒng)效應(yīng)。各組大鼠42天試驗(yàn)結(jié)束后隨機(jī)抽取5只大鼠予以大劑量(2ml5mg/ml)相應(yīng)物質(zhì)的刺激，監(jiān)測(cè)7小時(shí)內(nèi)血壓變化以觀察循環(huán)系統(tǒng)效應(yīng)。各組剩余的5只大鼠經(jīng)口予以2ml

4、 50mg/ml的相應(yīng)物質(zhì)的刺激，30分鐘后灌胃給予100mg/ml的β-LG 1ml，分別于0.5、1、2、4和8小時(shí)后內(nèi)眥取血，離心分離血清，檢測(cè)血清中的β-LG以觀察胃腸系統(tǒng)滲透性的改變。 2.體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型研究按照美國藥典提供的模擬胃液、腸液配方，建立體外模擬胃腸消化體系，并模擬熱加工處理環(huán)境，選取常見食物致敏原蛋白(雞卵清蛋白、牛β-乳球蛋白)、不常見食物致敏原蛋白(牛血清白蛋白)和無致敏史食物蛋白(

5、大豆脂肪水解酶、馬鈴薯酸性磷酸酶)，研究這5種已知致敏性的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的消化和熱穩(wěn)定性，選出該模型的陽性和陰性對(duì)照，用以評(píng)價(jià)其它蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 3.胡桃蛋白Jug r1的原核表達(dá)與純化對(duì)已建立的工程菌進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序確認(rèn)構(gòu)建正確后，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件的探索。大量誘導(dǎo)表達(dá)Jug r 1蛋白包涵體，通過超聲破碎菌體分離并純化包涵體。將包涵體溶于6M鹽酸胍的包涵體溶解液中，并通過透析方法使其復(fù)性，得到Jugr1蛋白溶液。使用考馬斯亮蘭G2

6、50法測(cè)定蛋白含量，最后用低溫真空離心濃縮干燥機(jī)濃縮溶液。 4.Jug r1的致敏性研究體內(nèi)試驗(yàn)：選用腹腔注射致敏模型，30只雌性BN大鼠隨機(jī)分成3組：OVA組、Jug r 1組和PAP組。第1天經(jīng)腹腔注射途徑給予1ml 0.1mg/ml相應(yīng)的蛋白溶液，第5和10天重復(fù)兩次。第14、28、42天取血清檢測(cè)特異性IgE抗體，第21、35天取血漿檢測(cè)組胺含量。第42天后監(jiān)測(cè)血壓和進(jìn)行腸滲透性檢測(cè)。 體外試驗(yàn)：對(duì)Jug r1進(jìn)

7、行模擬胃液消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，設(shè)OVA為常見致敏原對(duì)照、BSA為不常見致敏原對(duì)照、PAP為非致敏原對(duì)照；進(jìn)行模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)，設(shè)OVA為常見致敏原對(duì)照、BSA為不常見致敏原對(duì)照、LPE為非致敏原對(duì)照。 結(jié)果： 1.B N大鼠致敏動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)口致敏模型：特異性抗體ELISA結(jié)果顯示第14、28、42天OVA均激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為10.5、12.3、12；PAP激

8、發(fā)的特異性IgG抗體滴度則較低，平均log<,2>IgG滴度分別為4、4.3、3.3；OVA激發(fā)一定程度的特異性IgE抗體，平均log<,2>IgE滴度分別為2、3.1、2.6，；而PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。PCA試驗(yàn)結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)特異性IgE抗體滴度分別為1：2、1：4、1：2，PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。組胺測(cè)定結(jié)果第21天OVA組大鼠血漿中組胺含量較陰性對(duì)照組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，O

9、VA組第35天和PAP組血漿中組胺含量較陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。血壓和腸滲透性均未測(cè)得有所改變。腹腔注射致敏模型：OVA+A1(OH)<,3>組有一只大鼠血壓出現(xiàn)暫時(shí)性下降，很快恢復(fù)正常。特異性抗體ELISA結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為14.8、16.7、17；OVA+A1(OH)<,3>激發(fā)較高的特異性IgG抗體，平均log<,2>IgG滴度分別為17

10、.6、16.1、17.7；PAP激發(fā)的特異性IgG抗體滴度則較低，平均log<,2>IgG滴度分別為4.6、5、3.4；OVA和OVA+Al(OH)<,3>都激發(fā)較高的特異性IgE抗體，OVA組平均log<,2>IgE滴度分別為4.3、5.1、3.8，OVA+A1(OH)<,3>組平均log<,2>IgE滴度分別為6、7.4、5.6；而PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。PCA試驗(yàn)結(jié)果顯示第14、28、42天OVA激發(fā)特異性IgE抗體滴度分

11、別為1：8、1：16、1：4，OVA+Al(OH)<,3>激發(fā)特異性IgE抗體滴度分別為1：16、1：64、1：16，PAP未能激發(fā)特異性IgE抗體。組胺測(cè)定結(jié)果第21、35天OVA和OVA+Al(OH)<,3>組大鼠血漿中組胺含量較陰性對(duì)照組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，PAP組血漿中組胺含量較陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。腸滲透性檢測(cè)結(jié)果顯示OVA組有一只大鼠在0.5小時(shí)血清中測(cè)得β-LG，OVA+Al(OH)<,3

12、>組有一只大鼠在0.5和l小時(shí)血清中都測(cè)得β-LG，一只大鼠在0.5小時(shí)血清中測(cè)得β-LG。 2.體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型研究OVA在模擬胃腸液中60min不降解穩(wěn)定存在，可作為模擬胃腸液消化穩(wěn)定性的陽性對(duì)照；但β-LG在模擬腸液中30min內(nèi)完全降解，因此不可作為模擬腸液消化穩(wěn)定性陽性對(duì)照；BSA在模擬胃液中30min內(nèi)完全降解，在模擬腸液中60min部分降解，可用作不常見致敏原蛋白對(duì)照；PAP在模擬胃液中15s即完全

13、降解，LPE在30s內(nèi)完全降解，都可作為模擬胃液消化穩(wěn)定性的陰性對(duì)照；而在模擬腸液中PAP 60min完全不降解，LPE 60min大部分降解，因此在模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)中應(yīng)選LPE為陰性對(duì)照。在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中，OVA、β-LG、BSA60min內(nèi)不降解，都可作陽性對(duì)照，PAP 60min內(nèi)完全降解，可作為陰性對(duì)照。 3.胡桃蛋白Jug r 1的原核表達(dá)與純化工程菌進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示克隆構(gòu)建成功。表達(dá)蛋白的可溶性分析標(biāo)明目的

14、蛋白以不溶的包涵體形式存在。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)IPTG 0.1mM誘導(dǎo)4小時(shí)時(shí)，Jug r 1蛋白表達(dá)量最高。大量表達(dá)、分離和純化后將包涵體溶于6M鹽酸胍的包涵體溶解液中，并通過透析方法使其復(fù)性得到Jug r 1蛋白溶液，考馬斯亮蘭G250法測(cè)定蛋白含量為393.9μg/ml，使用低溫真空離心濃縮干燥機(jī)濃縮溶液，得到終濃度為10mg/ml的Jug r1溶液。重復(fù)此過程得到約60ml的10mg/ml的Jug r 1溶液。 4.J

15、ug r 1的致敏性研究體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示施以受試蛋白Jug r 1處理的大鼠并未出現(xiàn)異常血壓，只激發(fā)了很低的特異性IgE抗體滴度(第28天時(shí)最高，僅為1：2)，組胺較陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，腸滲透性亦未測(cè)得改變。 結(jié)論： 1.本研究通過經(jīng)口和腹腔注射兩種常見致敏途徑，以常見致敏食物蛋白質(zhì)OVA、無致敏史的食物蛋白質(zhì)PAP給予BN大鼠，并選取有代表性的循環(huán)系統(tǒng)指標(biāo)(血壓)、免疫指標(biāo)(特異性IgE抗體、組胺)和胃腸系統(tǒng)指標(biāo)(

16、腸滲透性)作為判斷終點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)OVA可激發(fā)BN大鼠的過敏反應(yīng)，而PAP則不能。本研究認(rèn)為BN大鼠致敏動(dòng)物模型是評(píng)價(jià)食品致敏性較適合的動(dòng)物模型，OVA和PAP可分別作為模型的陽性和陰性對(duì)照蛋白，血壓、特異性IgE(ELISA法)和組胺以及腸滲透性(ELISA法)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并且致敏模型的應(yīng)用中不宜使用免疫佐劑。據(jù)此初步建立了致敏動(dòng)物模型，為研究后期和將來的食物致敏性研究打下了基礎(chǔ)，并提供了可靠的技術(shù)手段。 2.體外模擬胃腸消化環(huán)境

17、、熱加工處理環(huán)境，研究了不同致敏性的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的消化和熱穩(wěn)定性，確定適宜用于體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的參照蛋白：模擬胃液消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中設(shè)OVA為常見致敏原對(duì)照、BSA為不常見致敏原對(duì)照、PAP為非致敏原對(duì)照，模擬腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)中設(shè)OVA為常見致敏原對(duì)照、BSA為不常見致敏原對(duì)照、LPE為非致敏原對(duì)照。建立了體外模擬消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性模型，為評(píng)價(jià)其他蛋白質(zhì)是否具有致敏原蛋白特征提供了依據(jù)和手段。 3.通過大

18、腸桿菌原核表達(dá)胡桃蛋白質(zhì)Jug r 1。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件、純化方法、蛋白質(zhì)變性復(fù)性條件的嘗試和摸索，最終得到純度較高的Jug r 1蛋白質(zhì)溶液，為后期Jug r1致敏性研究做好了準(zhǔn)備。 4．利用前期建立的體內(nèi)和體外模型，對(duì)原核表達(dá)的Jug r1的致敏性進(jìn)行了一定的研究。體內(nèi)試驗(yàn)該蛋白并未顯示出致敏性，而體外試驗(yàn)結(jié)果卻提示該蛋白具有致敏原的特征(與牛血清白蛋白相似)，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果的差異可能與BN大鼠的敏感性和蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)有關(guān)。