冠心Ⅱ號主要吸收成分羥基紅花黃色素A抗動脈粥樣硬化的機理及相對貢獻度研究.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是脂質(zhì)代謝異常導致的動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，是冠心病、心肌梗死、高血壓等心血管疾病共同的病理基礎。冠心Ⅱ號由已故的著名中醫(yī)學家郭士魁先生所創(chuàng)制，方含丹參、川芎、赤芍、紅花和降香五味中藥（比例2∶1∶1∶1∶1），是治療冠心病的經(jīng)驗方。中醫(yī)方劑的療效作用是中藥中多種化學成分共同作用的結(jié)果。本實驗目的:①運用超高效液相色譜(UPLC)法測定冠心Ⅱ號中有效成分的含量，定

2、量分析阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種成分;②建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法定量定性分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號血漿中3種主要吸收成分阿魏酸、羥基紅花黃色素A和丹參素;③選用ApoE-/-小鼠并給予高脂飲食飼養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型，從氧化應激機制角度，研究冠心Ⅱ號主要吸收成分羥基紅花黃色素A抗動脈粥樣硬化的機理及相對貢獻度。
　　方法:
　?、俪咝б合嗌V(UPLC)法

3、測定冠心Ⅱ號中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種有效成分的含量。色譜條件:流動相:甲醇(A)和1％乙酸水(B);梯度洗脫;0min97％B;1min97％B;6min85％B;11min80％B;15min55％B。
　?、诔咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號血漿主要吸收成分的定性定量分析。色譜條件:流動相:甲醇(A)-0.1％甲酸(B);梯度洗脫:0min90％

4、B;5min40％B;6min10％B;7min10％B;8min90％B。質(zhì)譜條件:離子源:ESI(電噴霧電離，electrospray ionization);檢測方式:正離子模式;掃描方式:MRM(多反應監(jiān)測，multiple-reaetion monitoring);定量分析時的離子反應分別為m/z192.8-m/z133.96(阿魏酸)、m/z611-m/z491.04(羥基紅花黃色素A)和m/z196.8-m/z178.96

5、(丹參素)。
　?、圻x定主要吸收成分羥基紅花黃色素A，與母方冠心Ⅱ號對ApoE-/-小鼠抗動脈粥樣硬化的療效進行比較并明確機理，運用公式(相對貢獻度=成分療效÷母方療效×100％)，初步定量主要吸收成分羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號抗動脈粥樣硬化的相對貢獻度。在本課題研究中，以As模型組為參照，成分療效是指與As模型組比較，給予羥基紅花黃色素A干預后，各種藥效指標含量或表達水平上升或下降的變化差值;母方療效是指與As模型組比較，給予冠

6、心Ⅱ號干預后，各種藥效指標含量或表達水平上升或下降的變化差值，二者變化差值的比值即為羥基紅花黃色素A的相對貢獻度。選用ApoE-/-小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)8周建立動脈粥樣硬化模型，行血脂[甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]水平檢測、主動脈弓HE染色和油紅O染色以及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)含量測定;Real T

7、ime Q-PCR檢測胸腹主動脈腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)、白介素-1β(IL-1β) mRNA水平;Western Blot檢測胸腹主動脈TNF-α、VCAM-1、IL-1β表達。
　　結(jié)果:
　?、賃PLC法測定冠心Ⅱ號湯劑中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、原兒茶醛和芍藥苷5種有效成分的含量。15min內(nèi)5種成分良好分離，色譜峰單一且無雜峰干擾。線性回歸、精確度、準確度、回收率

8、、重現(xiàn)性和樣本穩(wěn)定性均良好。5種有效成分含量分別為:阿魏酸128.84±0.47(ng/mg·生藥)、羥基紅花黃色素 A1949.61±1.56(ng/mg·生藥)、丹參素270.38±1.95(ng/mg·生藥)、原兒茶醛184.84±0.80(ng/mg·生藥)、芍藥苷389.67±0.91(ng/mg·生藥)。
　　②UPLC-MS/MS法對C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號血漿3種主要吸收成分的定量定性分析，結(jié)果提示阿魏酸、

9、羥基紅花黃色素A、丹參素均可在血漿中檢測到，含量分別為:20.4ng/ml、154.0ng/ml和6.9ng/ml，其中羥基紅花黃色素A含量最高。
　?、圻x用ApoE-/-小鼠予以高脂飲食飼養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型，結(jié)果提示:a）.血清血脂水平檢測:與正常對照組相比，模型組TC、HDL-C、LDL-C水平增高，但TG沒有差異。冠心Ⅱ號和羥基紅花黃色素A干預后TC、HDL-C、LDL-C水平下降，其中羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號降低血脂

10、TC、HDL-C、LDL-C水平的相對貢獻度分別為:46.42％、64.09％、53.89％; b).HE染色鏡下可見動脈粥樣斑塊形成，油紅O染色可見脂質(zhì)及斑塊呈紅色。斑塊面積分析，模型組為(43.25±3.70)％，冠心Ⅱ號組為(30.20±1.48)％，羥基紅花黃色素A組為(35.63±2.06)％。羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號減少斑塊面積的相對貢獻度為58.39％;c）.血清MDA、SOD、GSH、CAT含量測定:與正常對照組相比，

11、模型組MDA含量增加，SOD、GSH、CAT水平下降;冠心Ⅱ號和羥基紅花黃色素A干預后MDA含量減少;SOD、GSH、CAT水平升高。羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號降低MDA含量和升高CAT、SOD、GSH水平的相對貢獻度分別為:55.79％、56.00％、32.61％、28.34％; d).Real Time Q-PCR檢測胸腹主動脈TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA水平:與正常對照組相比，模型組TNF-α、VCAM-1和IL

12、-1β mRNA表達水平升高;冠心Ⅱ號和羥基;花黃色素A干預后TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA表達水平下降;羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β mRNA表達水平的相對貢獻度分別為:81.83％、85.96％和82.67％;e).Western Blot檢測胸腹主動脈TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達:與正常對照組相比，模型組TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達升高;冠心Ⅱ號和羥基紅花

13、黃色素A干預后TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達下降;羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β表達的相對貢獻度分別為:58.88％、61.83％和52.17％。
　　結(jié)論:
　　①運用超高效液相色譜(UPLC)方法對冠心Ⅱ號湯劑中阿魏酸、羥基紅花黃色素A、丹參素、芍藥苷和原兒茶醛5種有效成分的含量測定，該方法快速靈敏、準確可靠、穩(wěn)定且重復性好。
　?、诓捎贸咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(UPL

14、C-MS/MS)法定性定量分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ號血漿中3種主要吸收成分為阿魏酸、羥基紅花黃色素A和丹參素，其中羥基紅花黃色素A含量最高。為研究羥基紅花黃色素A對冠心Ⅱ號抗動脈粥樣硬化的機理及相對貢獻度奠定了基礎。
　?、跘poE-/-小鼠經(jīng)過高脂飲食喂養(yǎng)8周后，形成了典型的冠狀動脈粥樣硬化病變。冠心Ⅱ號和羥基紅花黃色素A灌胃后，可以改善As病變小鼠血脂水平及斑塊進展程度。
　?、蹵s病變小鼠機體氧化應激狀態(tài)增強