羥基紅花黃色素A和11-羰基-β-乙酰乳香酸抗心肌氧化損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、在中醫(yī)理論中，“胸痹”、“心痛”的病理變化過(guò)程中均有心血瘀滯。若瘀在頭部（腦缺血）則會(huì)誘發(fā)腦卒中，若瘀在心臟（心肌缺血）則會(huì)造成心肌梗死。千百年來(lái)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療血瘀癥導(dǎo)致的心腦血管疾病中取得了很大進(jìn)展，療效確切，引人注目，前景廣闊。以紅花-乳香對(duì)藥為核心組成的數(shù)百方劑在“血瘀證”臨床治療中應(yīng)用廣泛，療效確切。1665年《外科達(dá)成》卷四已將紅花-乳香對(duì)藥命名為“活血定痛湯”，數(shù)百年來(lái)主治活血祛瘀，行氣止痛，二藥有“相須”“相使”作用，

2、但紅花-乳香活血抗氧化應(yīng)激損傷“相須”“相使”的作用機(jī)制不明。前期，我們?cè)趪?guó)科金（No.81173514）中，用首創(chuàng)的“藥效差示血清色譜法”研究發(fā)現(xiàn)，紅花和乳香的主要有效成分之中羥基紅花黃色素 A(HSYA)和11-羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)，均是治療血瘀證藥效物質(zhì)。本課題擬在血瘀證機(jī)體，揭示HSYA-AKBA對(duì)藥配伍“相須”“相使”的內(nèi)在相互作用機(jī)制，為今后含有HSYA-AKBA的方劑和中成藥研究提供創(chuàng)新性思路。
　　實(shí)驗(yàn)

3、目的：
　　1、探討HSYA和AKBA對(duì)藥配伍是否可減輕心肌缺血損傷，對(duì)心肌損傷有“相須”“相使”保護(hù)作用。
　　2、明確HSYA和AKBA對(duì)藥配伍能否有“相須”“相使”的減少心肌缺血損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用。
　　3、進(jìn)一步探究HSYA和AKBA對(duì)藥配伍調(diào)控氧化應(yīng)激信號(hào)通路（PGC-1α/Nrf2）在心肌損傷中的表達(dá)情況，明確該通路在心肌損傷中抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　體內(nèi)研究采用皮下注射1

4、00mg·kg-1鹽酸異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)大鼠心肌缺血損傷模型，復(fù)制血瘀證大鼠。體外研究采用暫時(shí)性氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞缺血損傷模型。觀察給予HSYA和AKBA后大鼠心電圖的改變，采用蘇木精-伊紅染色法（H&E）觀察心肌組織的病理性改變，檢測(cè)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）水平；并采用TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況和Hoechst33258染色法觀察H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改

5、變。采用Mito-sox和JC-1檢測(cè)線粒體內(nèi)ROS量和線粒體膜電位，同時(shí)檢測(cè)抗氧化系統(tǒng)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量變化；并進(jìn)一步采用免疫組化和蛋白印跡法來(lái)檢測(cè)HSYA和AKBA對(duì)藥配伍調(diào)控氧化應(yīng)激信號(hào)通路過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）和核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、HSYA和AKBA對(duì)藥配伍對(duì)心肌損傷有保護(hù)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，HSYA和AK

6、BA對(duì)藥配伍對(duì)ISO所致大鼠心肌缺血損傷模型的心功能有改善作用；并逆轉(zhuǎn)大鼠心肌組織病理性改變，能顯著改善ISO誘導(dǎo)大鼠心肌損傷造成的心肌纖維增生、斷裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)水腫；能顯著降低大鼠血清中心肌酶的CK-MB、LDH的含量(n=6，P<0.05)；同時(shí)TUNEL染色法檢測(cè)結(jié)果顯示HSYA和AKBA對(duì)藥配伍抑制心肌缺血損傷模型中心肌細(xì)胞的凋亡。在ISO治療組，TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞密集分布。HSYA和AKBA治療組表現(xiàn)出較小的T

7、UNEL陽(yáng)性細(xì)胞，百分比分別從34.57％下降到19.47%或19.61%(n=6，P<0.05)。與HSYA或AKBA組比較，HSYA和AKBA對(duì)藥配伍相須減少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(n=6，P<0.05)。體外實(shí)驗(yàn)，HSYA和AKBA對(duì)藥配伍在H9C2心肌細(xì)胞OGD損傷模型中也得到類似保護(hù)心肌細(xì)胞的結(jié)果。顯著降低H9C2心肌細(xì)胞心肌損傷酶的CK-MB、LDH的合成與釋放；同時(shí)Hoechst33258染色法檢測(cè)結(jié)果顯示有抗細(xì)胞凋亡作用。<

8、br>　　2、HSYA和AKBA對(duì)藥配伍有抗氧化應(yīng)激損傷作用。HSYA和AKBA對(duì)藥配伍合用相須降低線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生；同時(shí)能夠減輕ROS在線粒體中累積對(duì)線粒體膜電位的影響作用，降低線粒體膜電位，維持粒線體膜完整性、穩(wěn)定性。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明了HSYA和AKBA對(duì)藥配伍合用相須激活抗氧化酶系統(tǒng)，升高心肌組織的SOD酶活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化酶MDA水平。表明了HSYA和AKBA對(duì)藥配伍合用相須減少心肌缺血損傷是通過(guò)清除線粒體內(nèi)ROS水平而

9、獲得的。
　　3、HSYA和AKBA對(duì)藥配伍促進(jìn)心肌組織PGC-1α和Nrf2表達(dá)。采用心肌免疫組化分析和H9C2細(xì)胞免疫印跡檢測(cè)確定PGC-1α/Nrf2的信號(hào)是否參與HSYA或AKBA的心臟保護(hù)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)ISO誘導(dǎo)大鼠心肌損傷模型中心肌免疫組化分析表明HSYA和AKBA增加PGC-1α和Nrf2的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)OGD誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷模型中免疫印跡分析表明，HSYA和AKBA增加PGC-1α和Nrf2的表達(dá)。HSYA