羥基紅花黃色素A和一氧化氮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷。隨著冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)等血管再通術(shù)的迅速開(kāi)展，冠心病再灌注治療出現(xiàn)了一個(gè)飛躍。但MIRI也成為阻礙缺血心肌從再灌注療法獲得最佳療效的主要難題，如何減輕MIRI成為醫(yī)學(xué)界新的挑戰(zhàn)。 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是線粒體內(nèi)膜上的無(wú)選擇性通透孔。在生理?xiàng)l件下，Ca2+和活性氧組分(ROS)均是MPTP開(kāi)放最重要的誘導(dǎo)者。

2、而自由基的產(chǎn)生和鈣超載是MIRI的主要原因，研究表明MPT的抑制劑能阻止再灌注的心肌細(xì)胞的壞死和凋亡,實(shí)驗(yàn)表明，NO有較強(qiáng)的清除自由基作用，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)NO能降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，減輕鈣超載，進(jìn)而達(dá)到抗MIRI的作用[4-6]。環(huán)孢素A(CsA)是最有效的MPTP開(kāi)放抑制劑之一，對(duì)再灌注損傷的具有保護(hù)作用。 紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L．)的干燥花，有效主要成分集中在水溶性的黃色素部分，而在紅花

3、黃色素中含量最高且具有活性的成分為HSYA。 研究表明，HSYA可濃度依賴(lài)地抑制血小板活化因子(PAF)與家兔洗滌血小板(WRP)受體的結(jié)合；還能抑制PAF介導(dǎo)的WRP與兔多型核白細(xì)胞(PMNs)的聚集。HSYA可以減輕大鼠壓力超負(fù)荷所致的心肌肥厚，并能通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)的活性減少心肌梗死面積并保護(hù)缺血心肌。最近有報(bào)道HSYA可通過(guò)抗氧化作用保護(hù)腦缺血／再灌注(I／R)損傷。但HSYA是否能夠保護(hù)心

4、臟／再灌注損傷及其作用機(jī)制仍未明確。再灌注損傷營(yíng)救激酶(reperfusioninjurysalvageKinaSe，RISK)途徑是指在再灌注期間發(fā)揮抗細(xì)胞死亡心臟保護(hù)作用的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-ldmse，P13K)-Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase 1／2，ERK1／2)前生存激酶的信號(hào)級(jí)聯(lián)。再灌注早期RISK途徑的激活

5、可通過(guò)各種抗凋亡機(jī)制減輕再灌注損傷。 研究表明，多種預(yù)適應(yīng)方法和后處理能夠減輕再灌注損傷，而且這種保護(hù)作用與上述生存信號(hào)通路的活化相關(guān)[14,15]。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)HSYA抗心肌缺血再灌注損傷作用及機(jī)制的研究，著重探討了NO與MPTP調(diào)節(jié)的關(guān)系，并觀察了HSYA對(duì)Akt和ERK1／2活性的影響。 方法： 1.NO對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響采用離體大鼠心臟灌流方法，全心停灌30min和復(fù)灌120min模擬缺血

6、／復(fù)灌損傷，測(cè)定心肌梗死面積、冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)含量。提取大鼠心肌線粒體，分光光度法測(cè)定鈣誘導(dǎo)下520nm吸光度的改變。分離心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位。 2.HSYA抗缺血再灌注損傷的作用及其線粒體機(jī)制的研究采用離體大鼠心臟灌流方法，全心停灌30min和復(fù)灌120min模擬缺血／復(fù)灌損傷，測(cè)定心肌梗死面積、冠脈流出液中LDH含量。提取大鼠心肌線粒體，分光光度法測(cè)定鈣誘導(dǎo)下520nm吸光度的改變。

7、分離心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧模型測(cè)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位。Western blot測(cè)定缺血區(qū)心肌組織eNOS、p-eNOS蛋白的表達(dá)水平。 3.HSYA對(duì)大鼠缺血再灌注P13K-Akt和ERK1／2通路的影響采用離體大鼠心臟灌流方法，全心停灌30min和復(fù)灌120min模擬缺血／復(fù)灌損傷，Western blot測(cè)定缺血區(qū)心肌組織在復(fù)灌不同時(shí)間點(diǎn)Akt、p-Akt、ERK1／2、p-ERK1／2蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)觀察不同濃度HSYA

8、對(duì)Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果： 1.NO對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響I／R組心臟缺血30min、復(fù)灌120min后，梗死面積(梗死區(qū)占危險(xiǎn)區(qū)面積比值)f10(46.55±3.61)％。與I/R組相比，CsA(0.2μmol／L)預(yù)處理組心肌梗死面積明顯減小，復(fù)灌期間冠脈流出液中LDH含量降低。L-NAME(10μmol/L)明顯減弱CsA降低梗死面積和復(fù)灌期間冠脈流出液LDH的釋放的作用。用CsA預(yù)處理線粒

9、體后再加入200μmol／L CaCl2，A520下降不明顯。CsA可阻止△ψm去極化．CsA+L-NAME組TMRE熒光增強(qiáng)，F(xiàn)／F0增高，促進(jìn)其去極化． 2.HSYA抗缺血再灌注損傷的作用及其線粒體機(jī)制的研究與I／R相比HSYA治療組(0.05，0.1和0.2mmol／L)心梗面積顯著減少，并且LDH水平顯著下降。20umol／L MPTP的開(kāi)放劑atractyloside(Atr)可明顯抑制HSYA的心肌保護(hù)作用(46.1

10、2±4.32％)。NOS抑制劑L-NAME(10umol／L)可部分抵消HSYA對(duì)梗塞面積和LDH釋放的保護(hù)作用，促進(jìn)線粒體△ψm去極化。0.1mmol／L HSYA能夠抑制線粒體在A520處吸光度的下降，并阻止其△ψm的去極化。與對(duì)照組相比，0.1mmol／L的HSYA組eNOS的磷酸化水平顯著增高，而L-NAME可抑制其作用。 3.HSYA對(duì)大鼠缺血再灌注P13K-Akt和ERK1／2通路的影響HSYA組中Akt的表達(dá)水平與

11、對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，但p-Akt的表達(dá)明顯增加，再灌注0,5，10min與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較p-Akt分別增加了1.9倍、2.5倍和4.3倍。HSYA組在再灌注0,5，10min ERKl／2的表達(dá)水平與對(duì)照組中無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而且p-ERKl／2表達(dá)水平與對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.NO機(jī)制參與阻止心肌缺血再灌注時(shí)MPTP的開(kāi)放； 2.HSYA具有抗心肌缺血／復(fù)灌損