DOCK5基因敲除對肝臟脂肪酸合成和氧化的影響及其機制研究.pdf

1、本文分析了DOCK5基因敲除對肝臟脂肪酸合成和氧化的影響。本研究分為三個部分：
　　第一部分：DOCK5基因敲除對小鼠肝臟甘油三酯聚集的影響。
　　目的：利用普通飲食（SD）及高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)以C57BL/6J為背景的DOCK5基因敲除小鼠（DOCK5-/-）和非敲除小鼠（DOCK5+/+），初步探討 DOCK5基因敲除對小鼠肝臟甘油三酯（TG）聚集及非酒精性脂肪肝的影響。
　　方法：7周齡健康雄性DOCK5+/

2、+小鼠和DOCK5-/-小鼠各10只，分別適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為普食喂養(yǎng) DOCK5+/+小鼠組（SD-DOCK5+/+組，n=5）、高脂喂養(yǎng)DOCK5+/+小鼠組（HFD-DOCK5+/+組，n=5）、普食喂養(yǎng)DOCK5-/-小鼠組（SD-DOCK5-/-組，n=5）、高脂喂養(yǎng)DOCK5-/-小鼠組（HFD-DOCK5-/-組，n=5），各組小鼠均喂養(yǎng)24周。每周監(jiān)測體重，24周后留取各組小鼠肝臟組織和血漿，測定肝重、肝臟組織TG

3、含量以及血漿總膽固醇（TC）、TG、游離脂肪酸（FFA）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平；采用HE及油紅O染色了解各組小鼠肝臟脂肪變性的情況。
　　結(jié)果：SD-DOCK5-/-組與SD-DOCK5+/+組相比，小鼠體重、肝重、肝臟TG含量以及血漿TC、TG、FFA、ALT、AST水平均無統(tǒng)計學差異；HFD-DOCK5+/+組較SD-DOCK5+/+組小鼠上述指標均顯著升高（P＜0.05）；HFD-D

4、OCK5-/-組較HFD-DOCK5+/+組小鼠體重、肝重、肝臟TG含量以及血漿TC、TG、FFA水平均顯著升高（P<0.05），但ALT、AST水平兩組相比無明顯差異。SD-DOCK5-/-組與SD-DOCK5+/+組小鼠肝臟組織HE染色未見脂肪空泡形成，油紅O染色僅可見少許細小紅色脂滴形成；而HFD-DOCK5+/+組和HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟組織均可見脂肪空泡及較大紅色脂滴形成，且 HFD-DOCK5-/-組較HFD-D

5、OCK5+/+組小鼠肝臟組織脂肪空泡及紅色脂滴更大更多。
　　結(jié)論：在普食狀態(tài)下，DOCK5基因敲除對小鼠的肝臟TG聚集無明顯影響；在高脂飲食狀態(tài)下，小鼠肝臟TG沉積增加，出現(xiàn)脂肪變性， DOCK5基因敲除可以加重TG在小鼠肝臟內(nèi)的聚集，從而促進非酒精性脂肪肝的發(fā)展。
　　第二部分：DOCK5基因敲除對小鼠肝臟脂肪酸合成和氧化及相關(guān)信號通路的影響。
　　目的：通過檢測普食及高脂喂養(yǎng)的DOCK5+/+和DOCK5-/-小

6、鼠肝臟中與 FA合成和氧化相關(guān)基因以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），包括c-Jun N末端激酶（JNK）、胞外信號調(diào)控激酶（ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的表達，研究DOCK5基因敲除對肝臟FA合成和氧化的影響以及對上述信號分子MAPK信號通路的影響。
　　方法：利用實時的熒光定量PCR（RTFQ PCR）檢測普食和高脂喂養(yǎng)24周后的 DOCK5+/+和 DOCK5-/-小鼠（ SD-DOCK5+/+組、S

7、D-DOCK5+/+組、HFD-DOCK5+/+組、HFD-DOCK5-/-組，均 n=5）FA合成相關(guān)酶Acc、Fasn和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pparγ以及FA氧化相關(guān)酶Cpt1、Mcad和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pparα的mRNA表達；利用Western blot檢測肝臟組織PPARγ、PPARα以及信號分子JNK、ERK、p38 MAPK的蛋白表達。
　　結(jié)果：SD-DOCK5-/-組與SD-DOCK5+/+組小鼠相比，肝臟Acc、Fasn、

8、Pparγ、Cpt1、Mcad、Pparα的 mRNA表達均無明顯差異；HFD-DOCK5+/+組小鼠肝臟Acc、Fasn、Pparγ的mRNA表達均顯著高于SD-DOCK5+/+組（P<0.05），Cpt1、Mcad、Pparα的mRNA表達均顯著低于SD-DOCK5+/+組（P<0.05）；同時HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟Acc、Fasn、Pparγ、Cpt1、Mcad、Pparα的 mRNA表達較 HFD-DOCK5+/+組

9、均顯著升高（P<0.05）。各組 PPARγ和 PPARα蛋白表達也同相應(yīng)mRNA的表達結(jié)果相一致。SD-DOCK5-/-組與 SD-DOCK5+/+組小鼠相比，肝臟JNK、ERK、p38MAPK的蛋白磷酸化水平均無統(tǒng)計學差異；HFD-DOCK5+/+組與 SD-DOCK5+/+組小鼠相比，肝臟 JNK、ERK、p38MAPK的蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.05）；HFD-DOCK5-/-組與HFD-DOCK5+/+組小鼠相比，肝臟

10、JNK、ERK蛋白磷酸化水平顯著降低（P<0.05），但兩組小鼠肝臟p38MAPK的蛋白磷酸化的水平無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：在普食狀態(tài)下，DOCK5基因敲除對小鼠肝臟FA合成和氧化及MAPK信號通路無明顯影響；在高脂狀態(tài)下，小鼠肝臟FA合成增加及氧化減少，JNK、ERK、p38MAPK信號分子激活， DOCK5基因敲除可以促進FA合成和氧化，抑制JNK、ERK信號分子激活。
　　第三部分：DOCK5基因敲除對飽和脂肪酸作用

11、的原代肝細胞脂肪酸合成和氧化作用的機制。
　　目的：通過研究不同條件下飽和脂肪酸作用的原代肝細胞FA合成和氧化及JNK、ERK信號分子的變化，在細胞水平探究DOCK5基因敲除對FA合成和氧化作用的可能分子機制。
　　方法：利用一定濃度棕櫚酸（PA）作用 DOCK5+/+和 DOCK5-/-原代肝細胞，構(gòu)建肝細胞脂肪變性模型，同時給予DOCK5+/+原代肝細胞JNK和ERK特異性抑制劑干預(yù)。通過western blot檢測各組

12、肝細胞JNK或ERK以及PPARγ、PPARα的蛋白表達變化。
　　結(jié)果：在PA作用下，DOCK5-/-原代肝細胞和加入了JNK或ERK抑制劑的DOCK5+/+原代肝細胞，其p-JNK或p-ERK蛋白表達均較未加抑制劑的DOCK5+/+原代肝細胞顯著降低（P<0.05），其PPARγ、PPARα蛋白表達均較未加抑制劑的 DOCK5+/+原代肝細胞顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：在飽和脂肪酸作用條件下，JNK、ERK抑制