“標本配穴”電針對心肌缺血大鼠細胞凋亡miRNA的影響及調控機制研究.pdf

1、目的：
　　心血管疾病是當今威脅人類健康和生命的主要疾病之一，心肌缺血是心血管疾病的主要因素。針刺用于防治心肌缺血已有數(shù)千年的歷史，具有操作簡便快捷、療效確切的特點，但其作用機制尤其是分子生物學機制目前尚不完全清晰，在一定程度影響了針灸在心肌缺血臨床的應用及推廣。
　　相關研究表明，在心肌缺血的過程中存在普遍心肌細胞凋亡表現(xiàn)，而細胞凋亡是受基因嚴格控制的，其中MicroRNA(miRNA)的調控具有關鍵作用。針刺是否是通過m

2、iRNA基因調控途徑干預心肌細胞凋亡？主要是通過什么miRNA基因調控的？主要的miRNA基因是通過什么信號調控途徑發(fā)揮作用的？這些都是需用研究的問題。
　　有據(jù)于此，本課題選用心肌缺血模型大鼠為研究對象，在中醫(yī)針灸“治未病”理論為指導下，采用“標本配穴”電針干預方法，以細胞凋亡為切入點，運用miRNA基因芯片篩選、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）及蛋白質印跡（Western blot）等技術，觀察心肌細胞凋亡相關miRNA及

3、其靶基因表達的影響及調控關系，探討“標本配穴”針刺干預心肌缺血的miRNA基因調控機制，以期為針刺防治心肌缺血疾病提供理論支撐和科學依據(jù)。
　　方法：
　　1.選用SPF級雄性Wistar大鼠40只，體重180-220g，隨機分為正常組、模型組、內關電針組（內關組）、標本配穴電針組（標配組），每組10只。模型組、內關組、標配組大鼠予異丙腎上腺素(ISO)2mg/(kg·d)腹部皮下注射,連續(xù)14天，后用BL-420生物機能系

4、統(tǒng)檢測模型組大鼠心電圖，以QRS波、QT波持續(xù)時間延長（QRS＞0.1s）、T波形態(tài)改變作為造模成功標志。正常組大鼠給予等量0.9％生理鹽水腹部皮下注射，連續(xù)14天。
　　正常組、模型組大鼠只抓取固定，不針刺治療。內關組針刺雙側“內關”（大鼠腕橫紋正中上5 mm，針刺深約0.5 cm），標配組針刺雙側“內關”、“關元”（大鼠臍下約25 mm，針刺深約0.5 cm）、雙側“足三里”（大鼠膝關節(jié)后外側、腓骨小頭下約5mm，針刺深約0.

5、8 cm），標配組同側穴位組成一對電極，內關組及標配組中內關穴在穴位右旁開0.5cm處另皮下淺刺一針作輔助電極，后連接HANS LH202H電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強度1mA，以大鼠肢體有震顫感為適宜強度，通電10min。每日治療1次，共21天。
　　大鼠于第22天行超聲心動圖機檢測大鼠左室舒張末期內徑( LVEDd)、左室收縮末期內徑( LVESD)、左室射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮短率（FS）；TUNEL法檢測大鼠心

6、肌細胞凋亡指數(shù)（AI）；ELISA法檢測血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、血管內皮細胞粘附分子1（VCAM-1）、內皮素1（ET-1）；實時熒光定量 PCR法檢測大鼠心肌組織 miRNA-133-3p、miRNA-133-5p、miRNA-1-3p、miRNA-486表達及靶基因Nol3、Caspase-3、Aifm2、Api5、RGD1564319、Aatk的表達。后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并對 miRNA與其靶基因進行相關性驗證。

7、>　　2.SPF級雄性Wistar大鼠12只，每組3只，分組、治療、取材方法同上。用微列陣基因芯片技術檢測各組大鼠心肌miRNA表達譜狀況。
　　3.SPF級雄性Wistar大鼠70只，隨機分為正常組、模型組、內關組、標配組、miRNA-133a-5p抑制劑組（抑制劑組）、miRNA-133a-5p激動劑組（激動劑組）、miRNA-133a-5p抑制劑+?標本配穴?電針組（抑制劑+標配組），每組10只。模型組、內關組、標配組、抑制

8、劑組、激動劑組及抑制劑+標配組造模方法與上（方法1）相同。抑制劑組、抑制劑+標配組腹部皮下按10mg/kg于實驗第1、7、14天進行 miRNA-133a-5p抑制（antagomir）劑注射，共3次；激動劑組注射miRNA-133a-5p激動（agomir）劑，劑量、方法同抑制劑組相同。正常組方法與上（方法1）相同。正常組、模型組、抑制劑組、激動劑組大鼠只抓取固定，不針刺治療。內關組、標配組、抑制劑+標配組進行電針治療，抑制劑+標配組

9、與標配組治療方法相同，電針治療方法與上（方法1）相同。
　　實驗第22天心臟取材，用實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠心肌組織miRNA-133-5p及其靶基因Caspase-3、Aifm2的表達；Western blot法檢測各組靶基因Caspase-3、Aifm2的表達，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及相關性分析。
　　結果：
　　1.模型組大鼠心臟LVEDd、LVESD高于正常組（均為P＜0.01），而EF、FS值均低于正常組（

10、均為P＜0.01）；內關組、標配組LVEDd、LVESD均低于模型組（均為P＜0.01），標配組低于內關組（分別為P＜0.01, P＜0.05）；內關組、標配組中EF、FS值均高于模型組（均為P＜0.01），標配組高于內關組（P＜0.05）。
　　2.正常組大鼠心肌AI值低于模型組（P＜0.01）；內關組、標配組均低于模型組（均為P＜0.01）；標配組低于內關組（P＜0.05）。
　　3.模型組大鼠血清CK-MB、VCAM-

11、1、ET-1值均高于正常組（均為P＜0.01）；內關組、標配組均低于模型組（均為P＜0.01）；標配組均低于內關組(均為P＜0.05)。
　　4.運用微陳列芯片技術共篩選出758個miRNA基因信號，有20個具有差異化意義的 miRNA基因信息：12個表達上調，8個表達下調；其中miR-133a-5p和miR-133a-3p上調趨勢、miR-1-3p和miR-486下調趨勢明顯優(yōu)于其它miRNA基因。通過TargetScan、mi

12、Randa和PicTar3種生物信息數(shù)據(jù)庫交叉對上述4個 miRNA基因與凋亡相關的靶基因進行預測：miR-133a-3p的靶基因為 Nol3，miR-133a-3p的靶基因為 Caspase-3和Aifm2，miR-1-3p的靶基因為Api5，miR-486的靶基因為RGD1564319和Aatk。
　　5.(1)模型組大鼠心肌miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達均低于正常組（均為P＜0.01），miRNA-1

13、-3p、miRNA-486表達均高于正常組（均為P＜0.01）；內關組、標配組miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達均高于模型組（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），標配組均高于內關組（分別為P＜0.05，P＜0.01）；內關組、標配組miRNA-1-3p、miRNA-486表達均低于模型組（分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），標配組均低于內關組（均為P＜0.05）

14、。(2)模型組心肌 Nol3表達高于正常組（P＜0.01），模型組與內關組、標配組沒有顯著差異（均為P＞0.05）；模型組 Caspase-3、Aifm2表達均高于正常組（均為P＜0.01），內關組、標配組均低于模型組（均為 P＜0.01），標配組均低于內關組（均為 P＜0.01）；模型組Api5表達低于正常組（P＜0.01），內關組與模型組無顯著差異（P＞0.05），標配組低于模型組（P＜0.05）；正常組RGD1564319表達與模

15、型組無顯著差異（P＞0.05）；模型組 Aatk表達高于正常組（P＜0.01），內關組與模型組無顯著差異（P＞0.05），標配組高于模型組（P＜0.05）。(3)整體組間相關性及相關系數(shù)強度分析：miRNA-133a-3p與Nol3、miRNA-1-3p與Api5為中度負相關；miRNA-486與Aatk為中度正相關；miRNA-486與RGD1564319為輕度負相關；miRNA-133a-5p與Caspase-3、Aifm2均為高度

16、負相關。
　　6.(1)模型組大鼠心肌miRNA-133a-5p表達低于正常組（P＜0.01）；內關組、標配組、激動劑組、抑制劑+標配組均高于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組低于模型組（P＜0.01）；標配組、激動劑組、抑制劑+標配組均高于內關組（分別為 P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），抑制劑組低于內關組（P＜0.01）；激動劑組高于標配組（P＜0.01），抑制劑組低于標配組（P＜0.01），抑制劑+標配組與標配組

17、無顯著差異（P＞0.05）。(2)模型組大鼠心肌 Caspase-3、Aifm2表達（qRT-PCR檢測）均高于正常組（均為 P＜0.01）；內關組、標配組、激動劑組、抑制劑+標配組均低于于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組高于模型組（分別為P＜0.01，P＜0.05）；標配組、激動劑組均低于于內關組（均為P＜0.01），抑制劑組高于內關組（均為P＜0.01），抑制劑+標配組與內關組無顯著差異（P＞0.05）；抑制劑組高于標配組（均為

18、P＜0.01），激動劑組、抑制劑+標配組與標配組無顯著差異（均為 P＞0.05）。(3)模型組大鼠心肌 Caspase-3、Aifm2表達（Western-blot檢測）均高于正常組（均為P＜0.01）；內關組、標配組、激動劑組、抑制劑+標配組均低于于模型組（均為P＜0.01），抑制劑組高于模型組（均為P＜0.05）；標配組、激動劑組均低于內關組（均為P＜0.01），抑制劑組高于內關組（均為P＜0.01），抑制劑+標配組（Caspase

19、-3）與內關組無顯著差異（P＞0.05），抑制劑+標配組（Aifm2）低于內關組（P＜0.01）；抑制劑組高于標配組（均為 P＜0.01），激動劑組、抑制劑+標配組與標配組無顯著差異（均為P＞0.05）。(4)整體組間相關性及相關系數(shù)強度分析：miRNA-133a-5p分別與 Caspase-3、Aifm2（ qRT-PCR、Western-blot檢測）均為較強負相關。
　　結論：
　　1.電針能夠通過降低心肌缺血模型大鼠

20、的LVEDd、LVESD值、提升EF、FS值，有效改善心肌缺血細胞凋亡導致的代償性心臟擴張、心功能低下，降低心肌細胞凋亡程度，且?標本配穴?電針法比單純內關電針法具有更好的效應。
　　2.對于心肌缺血細胞凋亡后引發(fā)的心肌酶等指標改變，“標本配穴”電針和內關電針法均能通過有效減少實驗大鼠血清CK-MB、VCAM-1及ET-1的活性表達發(fā)揮抗心肌缺血作用的，且“標本配穴”電針法比單純內關電針法具有更好的效應。
　　3.多miRN

21、A基因參與了異丙腎上腺所致的大鼠心肌缺血細胞凋亡過程，心肌缺血過程中，主要表現(xiàn)在miRNA-133-3p、miRNA-133-5p表達下降，miRNA-1-3p、miRNA-486上升；?標本配穴?電針法能夠通過有效地提升miRNA-133-3p、miRNA-133-5p的表達，降低miRNA-1-3p、miRNA-486的表達，其保護作用是通過調控這4個miRNA基因的方式抑制心肌細胞凋亡。
　　4.miRNA基因及其靶基因是影