博爾納病病毒感染人少突膠質(zhì)細胞差異microRNA表達和生物信息學(xué)分析.pdf

1、背景：博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）是引起博爾納病的病原體，最先被發(fā)現(xiàn)于德國博爾納鎮(zhèn)的軍馬中，引起急性腦脊髓非化膿性炎癥的地方性流行病。BDV是一種單股負鏈、非節(jié)段性、非細胞溶性的非逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有強烈的噬神經(jīng)性。BDV能感染大部分溫血動物，包括哺乳動物和鳥類等。雖然有關(guān)BDV在人類的自然感染和致病還缺乏直接證據(jù)，也未有爆發(fā)流行，但是有文獻對精神病人的流行病學(xué)調(diào)查顯示BDV有較高的陽性率，而且體外實驗已經(jīng)

2、證明BDV確能感染人神經(jīng)細胞，并對其增殖凋亡、代謝、蛋白組學(xué)和信號通路等產(chǎn)生明顯影響。但是BDV對于人神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA研究較為少見，其中人源病毒株Hu-H1對于人神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的研究也鮮有報道。利用miRNA芯片技術(shù)和RT-qPCR實驗對miRNA進行高通量篩選鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)分析，提出miRNA與BDV感染新的假說和課題方向，增強對BDV感染的認識。
　　目的：本實驗從miRNA的基本點出發(fā)，旨在探討人源BDV病

3、毒株Hu-H1干擾OL細胞miRNA的差異表達和生物學(xué)功能，為進一步BDV致病病理機制提供新支點。
　　方法：⑴復(fù)蘇本實驗保存的BDV長期感染的OL細胞，提取病毒液測定其滴度；擴增本實驗保存的pEGFP-N1-P40和pEGFP-N1-P24質(zhì)粒，用于后續(xù)細胞感染。⑵復(fù)蘇本實驗保存的無感染正常OL細胞，感染BDV-Hu-H1病毒，與對照組OL細胞同時培養(yǎng)14天后，測定其感染率并提取RNA；擴增和轉(zhuǎn)染本實驗保存的pEGFP-N1-P

4、40和pEGFP-N1-P24質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染正常的OL細胞后提取RNA。實驗分為OL組、OL/BDV組、OL/P40組、OL/P24組和OL/CON組。⑶提取上述各組細胞RNA進行miRNA芯片篩選實驗，將OL和OL/BDV組的差異miRNAs進行生物信息學(xué)分析。⑷將芯片篩選的差異miRNA進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）實驗驗證，從而確定具體差異。
　　結(jié)果：①病毒感染OL細胞14天后達到完全感染；質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染OL細胞并且P

5、24和P40蛋白正常表達。②miRNA芯片在正常的OL細胞和OL/BDV細胞中篩選出10個差異miRNA，其中4個上調(diào)（miRNA-1290, miRNA-1908, miRNA-424-5p, miRNA-146a-5p），6個下調(diào)（ miRNA-296-3p, miRNA-1244, miRNA-3676-3p, miRNA-4521, miRNA-4433-3p, miRNA-7-5p）。③將上述差異miRNA進行生物信息學(xué)（Pa

6、thway和GO）分析和差異miRNA靶基因的預(yù)測，分析對BDV對OL細胞相關(guān)信號通路和生物學(xué)功能的干擾和影響。④RT-qPCR實驗將上述差異miRNA進一步驗證，miRNA-1290，miRNA-1908，miRNA-424-5p，miRNA-146a-5p， miRNA-296-3p， miRNA-3676-3p，miRNA-7-5p等7個顯著下調(diào)（P<0.05）。miRNA-1244和miRNA-4521沒有顯著性差異（P>0.0