博爾納病病毒對人少突膠質細胞增殖與凋亡影響的初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種非細胞毒性的、單股負鏈的RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)細胞特性，能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)病毒感染，BDV宿主范圍很廣，據(jù)報道可引起鼠、馬、兔、狗等多種溫血類動物的自然感染或實驗室感染，并表現(xiàn)出以明顯的精神、行為異常等為特征的神經(jīng)精神臨床癥狀。同時，大量國內外的的流行病學調查顯示BDV感染可能與人類某些精神神經(jīng)疾病的發(fā)生有一定聯(lián)系，BDV能感染神經(jīng)元和神

2、經(jīng)膠質細胞，引起神經(jīng)細胞可塑性、代謝分泌功能改變，但感染具體機制研究國內外報道較少，其中BDV對神經(jīng)膠質細胞的感染機制研究更為少見。
　　本研究通過BDV實驗感染人少突膠質細胞(oligodendrocyte cells，OL cells)，針對血清濃度單因素改變對BDV病毒滴度結果的影響進行比較，探討選擇BDV感染細胞適宜的血清濃度，以進一步開展BDV感染神經(jīng)細胞研究，另一方面在最適宜血清濃度培養(yǎng)條件下用病毒感染細胞，觀察其對O

3、L細胞的增殖生長和凋亡的影響，并探討病毒致病相關分子機制。
　　方法：
　　1、復蘇OL/BDV3660株細胞，通過反復凍融方式獲取病毒液。將OL細胞在含不同濃度FBS的DMEM液條件下進行培養(yǎng)，同時制備不同稀釋倍數(shù)的病毒液，依次用不同稀釋濃度的病毒液感染細胞，常規(guī)培養(yǎng)7日后，通過免疫組化方法檢測病毒陽性細胞集落數(shù)，計算出最適合該病毒感染少突膠質細胞的血清濃度。
　　2、培養(yǎng)OL細胞，加入BDV病毒液感染OL細胞，通過

4、BDV核蛋白免疫熒光實驗鑒定BDV感染是否成功，以建立BDV感染的OL細胞模型。
　　3、采用CCK8試劑盒，分別測定BDV感染OL細胞1～7天的生長增殖情況，繪制生長曲線。同時采用流式細胞技術測定BDV感染OL細胞24內不同時間點，細胞周期各期的DNA含量，觀察感染對增殖能力的影響。收集BDV感染1、3、5天的OL細胞，采用流式細胞技術，測定凋亡細胞數(shù)目。
　　4、培養(yǎng)細胞，分別提取BDV感染1、3、5天的OL細胞蛋白，采

5、用Western-blot方法檢測凋亡相關指標Bcl-2、Bax的蛋白相對表達量變化。
　　結果：
　　1、病毒滴度測定后顯示，在2％FBS培養(yǎng)條件下，病毒滴度測定值相比其它幾種培養(yǎng)條件更高。
　　2、通過免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)，BDV感染OL細胞3天和5天時，均可發(fā)現(xiàn)P40蛋白綠色熒光表達，說明BDV感染OL細胞成功。
　　3、通過CCK8試劑盒測定OL細胞增殖能力發(fā)現(xiàn)，BDV感染細胞7天內，隨著時間的增加，細胞的數(shù)

6、量逐漸增多。但與對照組OL細胞相比，感染組細胞的增殖能力明顯更低(P<0.05)。
　　4、采用流式細胞技術測定BDV感染OL細胞24小時內的周期變化發(fā)現(xiàn)，感染細胞周期G2期延遲，細胞增殖指數(shù)降低。采用流式細胞技術測定凋亡細胞數(shù)目發(fā)現(xiàn)，在BDV感染OL細胞3天和5天時，感染組檢測到的凋亡細胞數(shù)明顯多于對照組細胞(P<0.05)。
　　5、采用Western-blot免疫印跡方法檢測凋亡相關標志物Bcl-2、Bax的蛋白相對表

7、達量發(fā)現(xiàn)，在感染3天和感染5天時，感染組細胞的促凋亡標志Bax的蛋白表達量明顯高于對照組細胞；而感染組細胞抑凋亡標志Bcl-2的蛋白表達量明顯低于對照組(P<0.05)。
　　結論：
　　1、不同濃度血清的病毒培養(yǎng)條件可影響B(tài)DV對細胞的感染力，2％FBS的培養(yǎng)條件可能更適合于BDV感染OL細胞實驗。
　　2、BDV感染可以抑制OL細胞增殖生長，并可能通過上調Bax蛋白和下調Bcl-2蛋白的相對表達量，從而參與誘導細胞