丙烯酰胺誘導(dǎo)的神經(jīng)絲改變的干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　丙烯酰胺(acrylamide，ACR)作為一種乙烯基單體，是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料;聚丙烯酰胺在工業(yè)上應(yīng)用十分廣泛。目前已知ACR具有多種毒性，如致癌性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性等。近年來(lái)，ACR的神經(jīng)毒性備受關(guān)注。職業(yè)暴露于ACR的神經(jīng)毒作用的主要臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、骨骼肌肉無(wú)力、認(rèn)知障礙、四肢麻木;在電鏡下ACR中毒的主要病理表現(xiàn)為腫脹的軸突末端神經(jīng)絲(neurofilaments，NFs)堆積。鈣蛋白酶(ca

2、lpain)作為一類(lèi)依賴(lài)鈣離子(Ca2+)激活的中性半胱氨酸水解酶，具有降解NFs的作用，在ACR誘導(dǎo)的神經(jīng)病變中發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠ACR亞慢性中毒及鈣蛋白酶抑制劑calpeptin(CP)干預(yù)模型，觀察大鼠行為學(xué)指標(biāo)變化，檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及calpain活性、NFs含量在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的變化，探討ACR誘導(dǎo)的NFs改變的干預(yù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.將36只無(wú)特定病原體級(jí)的成

3、年健康Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為4組，每組各9只。A組為空白對(duì)照組，給予生理鹽水腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.);B組為CP對(duì)照組，給予200μg/kg CP(i.p.);C組為ACR中毒模型組，給予30mg/kg ACR（i.p.）;D組為CP干預(yù)模型組，在給予大鼠30mg/kgACR1h后，給予200μg/kg CP（i.p.）干預(yù)。每周隔天給予ACR染毒，3次/周，連續(xù)4周;每周隔天給予C

4、P干預(yù)，早晚各一次，6次/周，連續(xù)四周。
　　2.染毒期間，每周進(jìn)行一次體重的測(cè)量及步態(tài)評(píng)分、后肢撐力指標(biāo)的測(cè)定。
　　(1)步態(tài)評(píng)分:觀察大鼠的自由活動(dòng)情況，并根據(jù)其步態(tài)受損程度進(jìn)行賦分，分別為1～4分。1分為正常步態(tài)、2分為輕度異常步態(tài)、3分為中度異常步態(tài)、4分為重度異常步態(tài)。每只大鼠觀測(cè)3次，取平均值。
　　(2)后肢撐力:將大鼠從距離著陸的水平地面30cm高處自由水平落下，測(cè)量雙后肢爪尖滑開(kāi)的最遠(yuǎn)距離，記為后肢

5、撐力指數(shù)，單位為cm。每只大鼠測(cè)量3次，取平均值。
　　3.染毒結(jié)束后第二日處死大鼠，提取大腦及坐骨神經(jīng)組織。制備大腦細(xì)胞懸液，使用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢查細(xì)胞的成活率。使用鈣離子熒光探針（Flua-2/AM）負(fù)載，測(cè)定細(xì)胞懸液熒光強(qiáng)度，計(jì)算Ca2+濃度。
　　4.將大腦、坐骨神經(jīng)組織進(jìn)行勻漿、離心提取上清液并進(jìn)行蛋白定量，使用具有熒光特性的calpain substrateⅡ結(jié)合calpain，以7-氨基-4-甲基香豆素為標(biāo)準(zhǔn)熒

6、光物質(zhì)，測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算calpain活性。
　　5.應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白免疫印跡方法，對(duì)大腦、坐骨神經(jīng)組織中NFs含量進(jìn)行半定量分析。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠體重的改變
　　染毒終點(diǎn)，與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組無(wú)顯著變化（P＞0.05），ACR中毒模型組大鼠體重降低了11.3％(P＜0.01)，而CP干預(yù)模型組無(wú)顯著變化（P＞0.05）;與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組大鼠體重

7、升高了8.3％(P＜0.01)。
　　2.大鼠步態(tài)評(píng)分、后肢撐力的改變
　　(1)步態(tài)評(píng)分:染毒終點(diǎn)，與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），ACR中毒模型組及CP干預(yù)模型組大鼠步態(tài)評(píng)分分別升高了167％（P＜0.01）、100％（P＜0.01）;與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組大鼠步態(tài)評(píng)分降低了25.1％(P＜0.01)。
　　(2)后肢撐力:染毒終點(diǎn)，與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組無(wú)顯著差異（P

8、＞0.05），ACR中毒模型組及CP干預(yù)模型組大鼠后肢撐力指數(shù)分別升高了76.7％(P＜0.01)、49.5％(P＜0.01);與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組大鼠后肢撐力指數(shù)降低了15.4％（P＜0.01）。
　　3.大腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變
　　與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組Ca2+濃度無(wú)顯著變化（P＞0.05）;ACR中毒模型組Ca2+濃度顯著升高了44.6％（P＜0.01）;CP干預(yù)模型組Ca2+濃度有所

9、升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組Ca2+濃度顯著降低了22.6％(P＜0.01)。
　　4.大腦、坐骨神經(jīng)組織內(nèi)calpain活性的改變
　　(1)大腦calpain活性的改變
　　與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組calpain活性顯著降低了14.3％(P＜0.01);ACR中毒模型組及CP干預(yù)模型組大鼠calpain活性分別升高了21.9％(P＜0.01)、11.5％（P＜0.

10、01）。與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組calpain活性顯著降低了8.5％(P＜0.01)。
　　(2)坐骨神經(jīng)calpain活性的改變
　　與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），ACR中毒模型組及CP干預(yù)模型組大鼠calpain活性分別升高了27.6％(P＜0.01)、11.7％(P＜0.01);與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組大鼠calpain活性降低了12.4％(P＜0.01)。5.大腦

11、、坐骨神經(jīng)組織內(nèi)NFs含量的改變
　　(1)大腦組織內(nèi)NFs含量的變化
　　與空白對(duì)照組相比，CP對(duì)照組NFs三個(gè)亞基低分子量神經(jīng)絲(lightneurofilament，NF-L)、中分子量神經(jīng)絲(medium neurofilament，NF-M)、高分子量神經(jīng)絲（heavy neurofilament，NF-H）含量分別升高了2.3％、降低了0.8％、升高了0.3％，變化均無(wú)顯著性差異(P＞0.05); ACR中毒模型

12、組三個(gè)亞基分別升高了85.3％（P＜0.01）、74.3％(P＜0.01)、82.9％(P＜0.01); CP干預(yù)模型組三個(gè)亞基分別升高了32.4％(P＜0.01)、30.6％（P＜0.01）、32.3％(P＜0.01);與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組三個(gè)亞基分別降低了28.5％(P＜0.01)、25.1％(P＜0.01)、27.7％(P＜0.01)。
　　(2)坐骨神經(jīng)組織內(nèi)NFs含量的變化
　　與空白對(duì)照組相比，

13、CP對(duì)照組NF-L、NF-M、NF-H含量分別升高了14.3％(P＜0.05)、28.6％（P＜0.01）、10.1％（P＞0.05），ACR中毒模型組三個(gè)亞基分別降低了56.0％(P＜0.01)、55.5％（P＜0.01）、39.3％（P＜0.01），CP干預(yù)模型組三個(gè)亞基分別降低了25.6％（P＜0.01）、33.6％（P＜0.01）、16.9％(P＜0.05);與ACR中毒模型組相比，CP干預(yù)模型組三個(gè)亞基分別升高了69.1％(P