丙烯酰胺對紋狀體神經(jīng)末梢多巴胺相關轉運蛋白的影響.pdf

1、丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種從水合丙烯腈中提取出來的具有乙烯基的水溶性有機化合物,是國內外廣泛應用于化工冶煉、污水處理、紡織加工及化妝品生產的一種化學原料。早在20世紀70年代就有職業(yè)性中毒的報道,主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,除職業(yè)接觸外,在飲用水、高溫油炸食品和食品的包裝材料中都可以檢測到單體丙烯酰胺的存在,由于其可以直接經(jīng)口進入人體,從而引起了社會的高度關注。有關流行病學調查和實驗研究發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺對人和實驗動物除了有

2、生殖毒性、遺傳毒性及致癌性等作用以外,還有明顯的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺急性、亞急性中毒主要以損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主,表現(xiàn)為神經(jīng)精神癥狀和小腦共濟失調,而慢性中毒則以損害周圍神經(jīng)系統(tǒng)為主,關于其機制目前尚不清楚。
　　紋狀體作為基底節(jié)最大的綜合處理元件,包含著大量的多巴胺能神經(jīng)元,在整個腦部中的多巴胺神經(jīng)遞質含量最高。在多巴胺能系統(tǒng)神經(jīng)通路中多巴胺神經(jīng)遞質首先在突觸前膜中進行合成、轉運、釋放、降解,以達到突出間隙中多巴胺神經(jīng)遞質的平衡,突

3、觸間隙中的多巴胺神經(jīng)遞質進入突觸后膜發(fā)揮突觸后效應,而多巴胺相關轉運蛋白在整個過程中發(fā)揮著重要作用,維持突觸間隙中多巴胺神經(jīng)遞質的平衡,當該平衡被打破后神經(jīng)系統(tǒng)就會出現(xiàn)不同程度的病癥,主要表現(xiàn)在感覺運動整合、軀體平衡運動及學習記憶等方面。以往對ACR的人群流行病學和實驗研究時所出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀和體征,似乎很大程度上預示著與紋狀體多巴胺神經(jīng)通路中多巴胺神經(jīng)遞質平衡被打破有關。
　　但直至目前,有關丙烯酰胺影響紋狀體維持多巴胺神經(jīng)遞質平

4、衡的相關轉運蛋白的研究報道較少,其具體機制仍未完全明確。因此,本研究擬通過體內和體外實驗的結合,檢測丙烯酰胺對多巴胺轉運體、單胺囊泡轉運體及多巴胺合成酶—酪氨酸酸羥化酶的影響,探討其引起神經(jīng)毒性的可能機制,為防治丙烯酰胺中毒提供理論依據(jù)。
　　第一部分丙烯酰胺對大鼠神經(jīng)行為毒性的影響
　　目的：探討丙烯酰胺對大鼠神經(jīng)行為毒性的影響。
　　方法：健康成年雄性SD大鼠40只,體重230±20g,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗

5、動物中心提供,合格證號:SCXK(鄂)2010-0007號。大鼠在10h:14h明暗光循環(huán)的動物房內,自由飲水、攝食,檢疫觀察7天后用于實驗。將大鼠按體重隨機分為4組,分別為對照組、低劑量(20mg/kg)組、中劑量(30mg/kg)組、高劑量(40mg/kg)組,每組10只,均單籠飼養(yǎng)。按照對應的染毒劑量對各ACR劑量組進行灌胃染毒,對照組則灌胃給予等容量的生理鹽水,每周連續(xù)染毒5天間隔2天,總共19天,并于第0,6,13,19天稱量

6、體重并進行步態(tài)評分,于第0,19天測定大鼠的后肢支撐力和甩尾時間。末次給藥24小時后,斷頭處死大鼠,迅速取出腦組織,用預冷PBS緩沖液洗凈,稱量大小腦重量,并于冰盤上迅速分離紋狀體、大腦皮層及小腦,并用干凈濾紙吸干置于﹣80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龃笫笮?、肝、脾、肺、腎、睪丸等臟器,稱量重量并記錄。
　　結果：(1)在整個染毒期內低劑量組大鼠雖然體重增長始終低于對照組,但差異無顯著性;與對照組比較,中劑量組大鼠平均體重于第19d明顯

7、降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);高劑量組大鼠平均體重于第6d、13d、19d也明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組大鼠平均體重于第19d明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(2)臟器系數(shù)顯示,高劑量組大小腦、心臟、肺臟、腎臟及睪丸臟器系數(shù)均有增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。(3)染毒第6d、13d、19d,與對照組比較,低、中、高劑量組步態(tài)評分均明顯升高

8、,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且染毒結束后,其分值分別集中于1-2、2-3、3-4分之間,并呈現(xiàn)出時間—劑量—效應關系。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組步態(tài)評分于第6d、13d、19d也明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。(4)染毒第19d,與對照組相比,低、中、高劑量組后肢支撐力指數(shù)均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且呈現(xiàn)出劑量—效應關系。另外,與低、中劑量組相比,高劑量組后肢支撐力指數(shù)也明顯

9、增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(5)染毒第19d高劑量組的甩尾時間比對照組明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結論：ACR亞急性染毒能導致大鼠體重下降;大小腦、心臟、肺臟、腎臟及睪丸臟器系數(shù)增加;步態(tài)評分增高;后肢支撐力指數(shù)增加;甩尾時間縮短。具有明顯的神經(jīng)毒性,主要引起感覺運動功能異常。
　　第二部分丙烯酰胺對大鼠多巴胺相關轉運蛋白mRNA和蛋白表達的影響
　　目的：探討丙烯酰胺對大鼠紋狀體多巴

10、胺轉運體(DAT)、單胺囊泡轉運體(VMAT2)和酪氨酸羥化酶(TH)mRNA表達和蛋白水平的影響。
　　方法：動物分組及處理同第一部分。實時熒光定量PCR技術檢測大腦皮層、小腦和紋狀體內DAT、VMAT2、THmRNA表達水平,并檢測紋狀體中MAO-BmRNA表達水平;WesternBlot蛋白印跡技術檢測紋狀體內DAT、VMAT2、TH的蛋白表達水平。
　　結果：(1)大腦皮層結果顯示:與對照組比較,各劑量組VMAT2m

11、RNA表達水平均明顯降低,其中低、中劑量組分別降低了30％、29%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而高劑量組則降低了56%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。DAT、TH各組間差異均無統(tǒng)計學意義。(2)小腦結果顯示:與對照組比較,低、中、高劑量組DAT、VMAT2、THmRNA表達均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(3)紋狀體結果顯示:DATmRNA表達與對照組相比,低、中、高劑量組均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(

12、P<0.01);Westernblot結果顯示,高劑量組的糖基化DAT蛋白表達明顯降低,僅為對照組的78%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組VMAT2mRNA表達顯著降低(P<0.01),VMAT2蛋白表達也顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組THmRNA和蛋白表達均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比,高劑量組MAO-BmRNA表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學

13、意義(P<0.01)。
　　結論：ACR亞急性染毒不僅會使大鼠小腦中DAT、VMAT2、THmRNA表達降低,還會使紋狀體中DAT、VMAT2、MAO-BmRNA和蛋白表達降低,THmRNA和蛋白表達增加,提示ACR亞急性染毒會導致多巴胺神經(jīng)遞質的合成和轉運功能失常,引起胞質和突觸間隙中多巴胺含量改變,從而導致多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。
　　第三部分丙烯酰胺對PC12細胞多巴胺相關轉運蛋白的蛋白表達的影響
　　目的：探討

14、丙烯酰胺對PC12細胞中多巴胺轉運體(DAT)、單胺囊泡轉運體(VMAT2)和酪氨酸羥化酶(TH)蛋白表達的影響。
　　方法：取對數(shù)生長期的PC12細胞,分為1個對照組和6個染毒組,各染毒組ACR終濃度分別為0.1mmol/L,0.3mmol/L,0.6mmol/L,1.25mmol/L,2.5mmol/L,5mmol/L,染毒24h。用WesternBlot蛋白印跡技術檢測PC12細胞中DAT、VMAT2、TH的蛋白表達水平。<

15、br>　　結果：(1)DAT蛋白定量結果顯示:與對照組比較,0.6mmol/L和1.25mmol/L組PC12細胞中糖基化DAT明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與對照組比較,0.1mmol/L、0.6mmol/L、1.25mmol/L組非糖基化DAT也明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)VMAT2蛋白定量結果顯示:與對照組比較,0.6mmol/L-5mmol/L組PC12細胞中VMAT2明顯降低,差異具有統(tǒng)

16、計學意義(P<0.01);與0.1mmol/L和0.3mmol/L組比較,0.6mmol/L-5mmol/L組VMAT2也降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.5或P<0.01)。(3)TH蛋白定量結果顯示:與對照組比較,2.5mmol/L、5mmol/L組PC12細胞中TH含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
　　結論：ACR可以引起PC12細胞中DAT、VMAT2蛋白含量降低,同時還可以引起TH蛋白含量

17、升高,提示ACR可以引起PC12細胞中多巴胺神經(jīng)遞質的合成和轉運功能異常。
　　綜上所述,ACR亞急性染毒能導致大鼠體重下降,后肢支撐力指數(shù)增加,步態(tài)評分增高,甩尾時間縮短,說明其神經(jīng)毒性作用比較明顯;其作用于小腦和紋狀體后,不僅會使大鼠小腦中DAT、VMAT2、THmRNA表達降低,還會使紋狀體中DAT、VMAT2、MAO-BmRNA和蛋白表達降低及THmRNA和蛋白表達增加。另外,ACR還能引起PC12細胞中DAT、VMAT2