ALS-FTD突變基因C9orf72毒性機(jī)制的研究.pdf

1、目的：位于C9orf72基因非編碼區(qū)的六堿基 GGGGCC重復(fù)突變可以導(dǎo)致Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）及Frontotemporal dementia（FTD），其致病機(jī)制尚不明確。GGGGCC重復(fù)可以通過(guò)非ATG依賴翻譯多種多聚形式的重復(fù)蛋白，但是這些重復(fù)蛋白是否具有細(xì)胞毒性尚未知曉。本文在不同細(xì)胞中研究這些重復(fù)蛋白是否具有毒性，并且探索其在ALS和FTD致病機(jī)制中的作用。
　　方法：構(gòu)建

2、含有30個(gè)GGGGCC重復(fù)序列，并且能夠按照不同讀碼框分別表達(dá)多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA），多聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP），多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）的N端帶有FLAG標(biāo)簽的質(zhì)粒。同樣的方法構(gòu)建了GFP標(biāo)簽位于N端的多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA），多聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP），多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR），多聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）以及多聚脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）的質(zhì)粒。為

3、了排除這些質(zhì)粒中GGGGCC重復(fù)RNA毒性的影響，通過(guò)合成30個(gè)GGAAGA重復(fù)序列和30個(gè)GGAGCA重復(fù)序列，利用密碼子的簡(jiǎn)并性，分別構(gòu)建帶有FLAG標(biāo)簽和GFP標(biāo)簽的多聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）和多聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）質(zhì)粒。接著，在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒，通過(guò)PI染料免疫熒光觀察，MTT方法檢測(cè)這些重復(fù)蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性作用。同時(shí)為了觀察這些重復(fù)蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性，在NSC-34以及SH-SY5Y細(xì)胞

4、中過(guò)表達(dá)這些質(zhì)粒并用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。本論文用泛素蛋白酶體抑制劑MG132以及自噬抑制劑Bafilomycin A1處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以觀察這些蛋白對(duì)泛素蛋白酶體（UPS）和自噬途徑的影響。為探索含精氨酸重復(fù)蛋白對(duì)核仁功能的影響，利用熒光定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的核糖體RNA的含量。在HEK293細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)程表達(dá)重復(fù)蛋白后和核仁應(yīng)激誘導(dǎo)藥物ActD處理的細(xì)胞相對(duì)比，以確認(rèn)核仁應(yīng)激現(xiàn)象的產(chǎn)生。利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)，分析重復(fù)蛋白與哪

5、些蛋白相互作用，同時(shí)利用免疫共沉淀的方法進(jìn)一步確定與哪些蛋白相結(jié)合。利用免疫熒光方法在HEK293細(xì)胞中觀察這些重復(fù)蛋白對(duì)應(yīng)激顆粒形成的影響。
　　結(jié)果：在所采取的細(xì)胞模型中，這五種重復(fù)蛋白并不容易產(chǎn)生聚集，而且不受泛素蛋白酶體和自噬調(diào)控。此外，僅僅只有poly-GR和poly-PR定位于核仁，引起關(guān)鍵的核蛋白B23（nucleophosmin）從核仁轉(zhuǎn)運(yùn)至核質(zhì)，導(dǎo)致核仁應(yīng)激并引起細(xì)胞死亡。這兩種異常翻譯的重復(fù)蛋白----poly