基于內(nèi)部競爭性片段提高基因痕量突變檢測方法的構(gòu)建及臨床運用.pdf

1、腫瘤是機體細胞因失去正常調(diào)控，因過度增殖而形成的新組織，且可侵犯周圍組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤威脅著大眾健康并給社會家庭帶來沉重的負擔。有數(shù)據(jù)顯示，中國2015年因腫瘤死亡人數(shù)為281萬，即平均每天死亡人數(shù)約7500人，腫瘤防控形勢在中國依然嚴峻。盡早控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，降低其患病率與死亡率已經(jīng)成為相關(guān)研究者急需解決的重大問題。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，腫瘤相關(guān)基因位點的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診治及其預后與有著密切的關(guān)系，其中腫瘤相關(guān)基因位

2、點的改變即基因突變是指基因發(fā)生了堿基對組成或排列順序的改變。能夠引起腫瘤惡性增生的基因中，KRAS與其下游的核心分子BRAF基因突變是近年來研究的熱點，它們?nèi)魏我粋€的突變將促使絲裂原活化蛋白激酶途徑持續(xù)性激活，導致組織朝惡性增生的方向發(fā)展。更有臨床研究已經(jīng)證明，由于KRAS基因的突變往往導致臨床常用單克隆抗體藥物治療腫瘤的失效，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)將其推薦為單抗藥物用藥前檢查項目之一。
　　在種類繁多的基因突變檢測技術(shù)中，鎖

3、式PCR是檢測基因痕量突變有效的方法之一，其主要原理是使用鎖核酸探針提高堿基錯配識別能力，使檢測的靈敏度更高，符合基因突變檢測的要求。然而，這種方法仍然存在諸多問題，如需要特異性的DNA聚合酶、對擴增的DNA質(zhì)量要求高、擴增過程中有堿基人工錯配導致目的基因非特異性擴增的現(xiàn)象等，鑒于此，本課題擬采用內(nèi)部競爭性擴增片段的參與來降低檢測過程中的堿基人工錯配，避免目的基因非特異性擴增的現(xiàn)象，同時提高鎖核酸探針對大量的野生型基因的屏蔽，凸顯出基因

4、痕量突變的突變位點，從而構(gòu)建一種基于內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性PCR(wirePCR)，對基因痕量突變特異性擴增，通過實時熒光定量PCR達到基因痕量突變的檢出。
　　目的：
　　1.根據(jù)腫瘤中常見的基因突變位點，結(jié)合內(nèi)部競爭性擴增片段提高鎖核酸抑制野生型背景基因的辦法，構(gòu)建結(jié)直腸腫瘤中KRAS與BRAF基因痕量突變的wirePCR高靈敏度檢測方法，并對該方法反應條件進行優(yōu)化。
　　2.將構(gòu)建的wirePCR檢測

5、方法進行系統(tǒng)評價，并用優(yōu)化好的反應條件對臨床腸鏡活檢標本中KRAS與BRAF基因痕量突變進行檢測并做驗證分析。
　　3.進一步將內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性方法運用于微滴數(shù)字PCR，用以檢測循環(huán)腫瘤DNA基因痕量突變。
　　4.構(gòu)建內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性多重熒光PCR反應體系，達到多種基因痕量突變同時檢測的目的。
　　方法：
　　1.設(shè)計合成引物對及熒光探針，對引物對和熒光探針濃度進行優(yōu)化、采

6、用溫度梯度PCR對退火溫度等條件進行優(yōu)化;用已知KRAS和BRAF基因常見突變位點設(shè)計合成LNA/DNA嵌合體探針，以LEPTIN基因作為加入的內(nèi)部競爭性擴增片段參與反應，構(gòu)建內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性基因痕量突變熒光定量檢測體系。并進一步對反應體系的引物、熒光探針、鎖核酸探針等反應條件進行優(yōu)化。
　　2.以突變型的的HT-29人結(jié)腸癌細胞系和野生型DNA按比例混合作為擴增模板，用上述構(gòu)建好的方法及優(yōu)化好的反應體系分別對突

7、變率50％、25％、10％、1％、0.1％、0.01％的模板進行wirePCR反應，并將擴增產(chǎn)物進行并將擴增產(chǎn)物進行測序，評價內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變檢測方法的靈敏度、特異性、及準確性等指標。
　　3.收集腸鏡活檢組織標本50例，檢測DNA濃度并將濃度統(tǒng)一調(diào)整至100ng/ul，按照優(yōu)化的wirePCR反應條件分別對臨床標本進行KRAS和BRAF基因突變檢測，同時結(jié)合20倍鏡下切片HE染色病理分析結(jié)果和直接

8、測序結(jié)果，對該方法檢測結(jié)果進行驗證。
　　4.為了適應微滴數(shù)字PCR的反應條件和操作流程，試驗中對KRAS、BRAF基因的上下游引物進行升級，選用具有更高TM值適應數(shù)字PCR的反應體系。相應地熒光探針也做了相應改進，選用帶VIC和FAM熒光基團的MGB探針參與反應體系，用構(gòu)建的內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性數(shù)字PCR檢測標本中循環(huán)腫瘤DNA的KRAS、BRAF基因痕量突變情況。
　　5.在內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型

9、抑制性基因痕量突變檢測的三重熒光反應體系中，內(nèi)參LEPTIN基因作為加入的內(nèi)部競爭性擴增片段，其引物及探針工作濃度與前期實驗一致，KRAS、BRAF基因痕量突變的熒光探針中的熒光基團分別采用VIC、HEX、FAM，并兩兩交叉搭配，結(jié)合前期優(yōu)化好的的引物和屏蔽野生型的鎖核酸探針濃度參與反應。
　　結(jié)果：
　　1.完成了相關(guān)引物對、熒光探針、及鎖核酸探針(LNA/DNA嵌合體)的設(shè)計與合成。加入反應體系的內(nèi)部競爭性擴增片段引物對

10、為HQ-329/330終濃度500nM熒光探針終濃度為100nM。確定了檢測KRAS基因突變檢測的最佳反應體系：引物對終濃度為500nM熒光探針終濃度250nM，針對KRAS基因野生型設(shè)計嵌合體探針HQ-144，其終濃度為500nM時能夠?qū)?0-150ng/μL的野生型模板能有效屏蔽;檢測BRAF基因突變的最佳反應體系：引物對終濃度為500nM熒光探針終濃度250nM，針對其野生型設(shè)計嵌合體探針HQ-356，其終濃度為500nM時能夠?qū)?/p>

11、50-200ng/μL的野生型模板能有效屏蔽，在加入反應體系的內(nèi)部競爭性擴增片段和屏蔽野生型鎖核酸探針作用下，循環(huán)數(shù)60cycles不會出現(xiàn)非特異性擴增的現(xiàn)象。
　　2.在評價內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變檢測方法的靈敏度、特異性試驗中，運用優(yōu)化好的wirePCR反應條件，能夠?qū)ν蛔儽壤挥?.01％的DNA模板有效檢出，并有較好重復性，該方法標準曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.996，擬合滿意，擴增效率較高。
　　

12、3.用構(gòu)建好的wirePCR方法對50例疑似結(jié)直腸癌腸鏡組織進行檢測，共檢測出18例KRAS基因突變型(36％)和8例BRAF基因突變的標本(16％)，本次檢查突變標本均為KRAS或BRAF基因單一突變型，沒有同時突變的現(xiàn)象，檢測結(jié)果和切片HE染色鏡下病理分析和直接測序結(jié)果相吻合。
　　4.內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性微滴數(shù)字PCR中，體系中的引物終濃度均采用900nM，探針終濃度均采用200nM，模板DNA濃度為50ng

13、/μL。在檢測KRAS基因痕量突變反應體系中，內(nèi)部競爭性片段擴增引物對采用HQ-329/330，F(xiàn)AM熒光探針選用HQ-1433，KRAS基因引物對采用HQ-1595/1596，其VIC熒光探針選用HQ-1438，生成總油滴數(shù)1145800個，KRAS突變基因檢出效率可以達到0.15％。在檢測BRAF基因痕量突變反應體系中，內(nèi)部競爭性片段熒光探針選用帶有VIC基團的HQ-1434，BRAF基因引物對采用HQ-1592/1594，熒光探針

14、選用帶有FAM熒光基團HQ-671。生成總油滴數(shù)928355個，BRAF突變基因檢出效率為0.11％。
　　5.內(nèi)部競爭性擴增片段參與的野生型抑制性基因痕量突變的三重熒光反應體系中，加入反應體系的內(nèi)參LEPTIN基因和待測KRAS、BRAF基因引物對與前期實驗條件一致，為了在相同CT值有相近的熒光強度，三重熒光反應體系中優(yōu)化好的探針分別為：內(nèi)部競爭性擴增片段即內(nèi)參LEPTIN基因探針帶有Texas Red熒光基團的探針HQ-129

15、4探針終濃度為100nM，KRAS基因擴增檢測中采用帶有VIC熒光基團的MGB探針HQ-1438，BRAF基因采用帶有FAM熒光基團的MGB探針HQ-671，熒光探針終濃度均為250nM，為避免反應中的非特異性擴增，退火溫度選用60℃，循環(huán)數(shù)60cycles。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建基于內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性特異性擴增基因痕量突變實時熒光定量檢測方法，選出適合結(jié)直腸腫瘤中KRAS基因痕量突變檢測的引物及探針，并

16、對反應體系的退火溫度，循環(huán)數(shù)等反應條件進行摸索，分別明確了加入內(nèi)部競爭性擴增片段、KRAS基因檢測的引物及探針最佳反應濃度。
　　2.構(gòu)建內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性的BRAF基因基因痕量突變實時熒光定量檢測方法，對引物、熒光探針和鎖核酸探針進行一系列優(yōu)化，使該反應體系可以對標本中的野生型DNA模板進行有效屏蔽，有較強選擇性擴增能力，對BRAF基因突變識別靈敏度可以達到0.01％，滿足基因痕量突變檢測條件。
　　3.將

17、內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性的基因痕量突變檢測方法運用于50例臨床結(jié)直腸腫瘤組織標本的KRAS和BRAF基因痕量突變檢測，本批標本中突變率分別為36％和16％，該方法靈敏度特異性高、操作與成本比直接測序法更有優(yōu)勢，可廣泛應用于臨床基因突變檢測，為腫瘤監(jiān)測及個體化用藥提供參考。
　　4.內(nèi)部競爭性擴增片段提高野生型抑制性的基因痕量突變檢測方法結(jié)合微滴數(shù)字PCR可以檢測循環(huán)腫瘤DNA的痕量突變，通過對野生型基因擴增的抑制，可以達