靈芝小RNA的分離與鑒定.pdf

1、靈芝，多孔菌科真菌赤芝，是一種珍貴的藥食兩用菌，是中藥（TCM）寶庫(kù)中的珍品。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)18-26個(gè)核苷酸（nt）長(zhǎng)度的非蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源小分子RNA，在基因表達(dá)中起著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。據(jù)研究報(bào)道，靈芝內(nèi)含有許多生物活性成分，包括多糖、生物堿、蛋白質(zhì)、靈芝酸、甾醇、氨基酸、三萜類(lèi)和微量元素等，并且這些成分的研究已經(jīng)非常清楚，但尚無(wú)小分子RNA，特別是microRNA的相關(guān)報(bào)道。本文旨在對(duì)靈芝microRNA開(kāi)展

2、初步研究，通過(guò)對(duì)其microRNA進(jìn)行分離與鑒定，為靈芝microRNA在醫(yī)藥領(lǐng)域中作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)，為靈芝在藥食用價(jià)值上的研究探索新的思路。
　　本研究采集了新鮮的靈芝子實(shí)體及靈芝孢子粉，分別采用傳統(tǒng)方法和Direct-zolTM RNA MiniprEP試劑盒法對(duì)新鮮靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉進(jìn)行總RNA的提取，其后對(duì)總RNA進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)以選擇出更好的材料和更優(yōu)的方法去開(kāi)展靈芝RNA的研究；應(yīng)用 Illumina測(cè)序平

3、臺(tái)對(duì)靈芝進(jìn)行小分子RNA高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行深度的分析，同時(shí)預(yù)測(cè)新的待選miRNA（PC miRNA）；挑選了7個(gè)microRNA（4個(gè)已知的microRNA，3個(gè)新的microRNA），采用熒光定量PCR和Northern Blotting方法對(duì)其進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）分別采用傳統(tǒng)方法和Direct-zolTM RNA MiniprEP試劑盒方法對(duì)靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉進(jìn)行總RNA提取，

4、總RNA濃度和純度分別為：傳統(tǒng)靈芝子實(shí)體—2510ng/μL，OD260/2801.84；Direct-zolTM RNA MiniprEP試劑盒法提取靈芝子實(shí)體—2054ng/μL，OD260/2802.00；傳統(tǒng)靈芝孢子粉—420ng/μL，OD260/2801.85；Direct-zolTM RNA MiniprEP試劑盒法提取靈芝孢子粉—270ng/μL，OD260/2801.99。結(jié)合電泳圖得出對(duì)于靈芝RNA的研究，選擇靈芝子

5、實(shí)體為材料，選擇Direct-zolTM RNA MiniprEP試劑盒法為提取方法。
　?。?）利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了靈芝小RNA文庫(kù)，共獲得小RNA文庫(kù)高質(zhì)量序列10,127,291條。去接頭、去污染后在靈芝小 RNA文庫(kù)中得到9,071,523（774,547 unique）條clean reads。對(duì)小RNA文庫(kù)中的clean reads進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)分析，截取了有效長(zhǎng)度區(qū)間序列（18-50 nt），其

6、中小RNA read數(shù)在30 nt(piRNA)、43 nt和50 nt處有較高的峰值，18-26 nt（主要是microRNA）小RNA序列占總小RNA（18-50 nt）50％左右，其中20 nt的序列最多。
　?。?）使用軟件miREvo對(duì)clean Reads進(jìn)行分析，共檢測(cè)到已知的miRNA132個(gè)，預(yù)測(cè)novel miRNA34個(gè)，新的miRNA的前體均能形成特征性發(fā)卡結(jié)構(gòu)；和Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，比對(duì)上ncRNA1

7、0436條。使用NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)及mage軟件對(duì)已知的miRNA進(jìn)行了簡(jiǎn)單的進(jìn)化分析。
　?。?）分別利用qRT-PCR和Northern blotting方法對(duì)挑選的7個(gè)miRNA(4個(gè)已知的miRNA和3個(gè)新的miRNA)進(jìn)行表達(dá)量分析以驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR中7個(gè)miRNA中有6個(gè)序列（glu-miR9386,glu-miR-125,glu-miR-99,glu-miR-99-1,PCmi

8、RNA1,PC miRNA3）均有較高的表達(dá)量，Northern blotting中有5個(gè)miRNA具有高表達(dá)量（glu-miR9386,glu-miR-125,glu-miR-99, glu-miR-99-1,PC miRNA2,PC miRNA3）。
　　本研究通過(guò)對(duì)靈芝小RNA的分離與鑒定分析及靈芝子實(shí)體microRNA的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)：靈芝內(nèi)存在數(shù)量眾多的小RNA，這預(yù)示著靈芝中可能存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制；本研究