新型抗CD133xCD3雙特異性抗體治療晚期結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建并表達(dá)純度較高的抗CD133xCD3雙特異性抗體，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)，并探討其可能的作用機(jī)制，期待為晚期結(jié)直腸癌患者找到一種更安全有效的治療方法。
　　方法：1.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建人鼠嵌合型抗人CD133xCD3雙特異性抗體(MS133)及抗人 CD133單克隆抗體(AC133)。2.利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá) MS133及 AC133，通過Protein A親和層析和 SP陽離子交換層析純化抗

2、體，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE和SEC-HPLC檢測(cè)抗體純度。3.通過流式的方法檢測(cè)MS133分別與細(xì)胞表面抗原位點(diǎn)CD133和CD3的結(jié)合能力，并利用CFSE、PI染料進(jìn)行細(xì)胞染色，檢測(cè)MS133包被激活的T細(xì)胞（activated T cell, ATC）對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT116、HT29、SW480）的殺傷情況和對(duì)正常組織細(xì)胞 MCF-10A的毒性效應(yīng)。4.選取 CD133高表達(dá)細(xì)胞株HCT116為

3、研究對(duì)象，使用CCK8試劑盒檢測(cè)MS133對(duì)其增殖的影響，并通過定量ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞殺傷過程中相關(guān)細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-4）的分泌情況。5.為了驗(yàn)證 MS133的體內(nèi)藥效，我們建立了兩種重癥免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）動(dòng)物模型，首先是MS133包被ATC細(xì)胞與HCT116細(xì)胞混合共注射模型；更進(jìn)一步驗(yàn)證是將HCT116細(xì)胞與 ATC細(xì)胞混合接種于小鼠皮下，尾靜脈抗體（MS133、hOKT3、h

4、IgG）給藥模型。
　　結(jié)果：1.制備的雙特異性抗體MS133分別用 SDS-PAGE和SEC-HPLC檢測(cè)，純度為84％和95%，抗體產(chǎn)量約為10 mg/L。2. MS133與CD3陽性細(xì)胞（Jurkat、ATC）和CD133陽性細(xì)胞（HCT116、HT29）均能很好的結(jié)合。MS133包被ATC細(xì)胞可高效殺傷CD133高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116和HT29,對(duì)CD133低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480及正常組織細(xì)胞株MCF-1

5、0A殺傷作用弱。3.在效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例較高時(shí)，MS133表現(xiàn)出顯著的HCT116增殖抑制效應(yīng)。另外，MS133靶向殺傷HCT116過程中，產(chǎn)生較高水平IFN-γ、GM-CSF細(xì)胞因子的分泌。4.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MS133包被ATC細(xì)胞可完全抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng)；此外，低劑量MS133注射可顯著抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，瘤體積及瘤重均小于單抗治療組，并且小鼠體重未出現(xiàn)明顯變化。
　　結(jié)論：1. MS133體外包被激活的T細(xì)胞可有效殺

6、傷CD133高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞，殺傷作用的強(qiáng)弱與細(xì)胞表面CD133表達(dá)水平相一致。2. MS133包被 ATC細(xì)胞可特異性殺傷CD133高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞，并且對(duì)CD133低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常組織細(xì)胞毒性作用較小。3. MS133介導(dǎo) ATC細(xì)胞靶向殺傷 CD133高表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的同時(shí)，IFN-r和GM-CSF分泌量也明顯增加，可能是MS133高效殺傷腫瘤細(xì)胞的一個(gè)機(jī)制。4.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MS133介導(dǎo)ATC細(xì)