基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣生物力學(xué)性能的影響.pdf

1、第一部分基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能的影響
　　目的：探討三種基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣去細(xì)胞效果，以及對瓣膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分和力學(xué)性能的影響，并與經(jīng)典去細(xì)胞方法比較。
　　方法：以單純水溶性蛋白溶解（HSA）、單純脂溶性蛋白溶解（LSA）、連續(xù)水溶性蛋白及脂溶性蛋白溶解（SHLS）和經(jīng)典方法（TSI）對豬主動脈瓣進(jìn)行去細(xì)胞處理。DAPI染色評價去細(xì)胞效果；組織學(xué)染色（HE、Ma

2、sson和EVG染色）評價不同去細(xì)胞方法對瓣膜結(jié)構(gòu)、膠原纖維和彈性纖維的影響。掃描電鏡觀察瓣膜表面的微觀結(jié)構(gòu)。定量檢測瓣膜的含水量、膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的含量，評價不同去細(xì)胞方法對ECM成分的影響。應(yīng)用單軸拉伸試驗進(jìn)行瓣膜力學(xué)性能測定，評價不同去細(xì)胞方法對力學(xué)性能影響。
　　結(jié)果：HSA去細(xì)胞方法對瓣膜結(jié)構(gòu)和ECM成分的損傷最小，但在四種去細(xì)胞方法中僅HSA不能完全去除瓣膜的細(xì)胞成分。LSA去細(xì)胞方法對瓣膜結(jié)構(gòu)

3、破壞嚴(yán)重，Masson染色顯示膠原纖維染色較淺，EVG染色顯示彈性纖維幾乎被完全去除。SHLS去細(xì)胞方法對瓣膜結(jié)構(gòu)影響較小，Masson染色顯示膠原纖維保存良好，EVG染色顯示彈性纖維輕度減少。TSI去細(xì)胞方法對瓣膜結(jié)構(gòu)亦有影響，Masson染色顯示膠原纖維有所減少，尤其是纖維層的膠原纖維；EVG染色顯示彈性纖維明顯減少。ECM定量檢測結(jié)果顯示四種去細(xì)胞瓣膜含水量均顯著高于天然瓣膜，且膠原蛋白含量與天然瓣膜差異無統(tǒng)計學(xué)意義；僅HSA去細(xì)

4、胞方法沒有降低瓣膜彈性蛋白含量，而LSA、SHLS和TSI去細(xì)胞瓣膜彈性蛋白含量較天然瓣膜顯著減少；四種去細(xì)胞方法均降低了瓣膜GAGs含量。力學(xué)性能測試結(jié)果顯示四種去細(xì)胞方法增加了瓣膜在周向和徑向上的極限拉伸應(yīng)變，但HSA、SHLS和TSI去細(xì)胞方法并沒有顯著降低瓣膜的極限抗張強(qiáng)度和彈性模量，而LSA去細(xì)胞瓣的周向彈性模量顯著下降。
　　結(jié)論：SHLS去細(xì)胞方法能有效去除豬主動脈瓣膜細(xì)胞成分，且對瓣膜結(jié)構(gòu)、ECM成分及力學(xué)性能損傷

5、較小。
　　第二部分基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣體外免疫原性及生物相容性的影響
　　第一節(jié)：基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣體外免疫原性的影響
　　目的：探討三種基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣中異種抗原的去除效果，評價不同去細(xì)胞方法處理的瓣膜體外對白細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)激活的影響，并與經(jīng)典去細(xì)胞方法比較。
　　方法：以HSA、LSA、SHLS和TSI對豬主動脈瓣進(jìn)行去細(xì)胞處理。免疫熒光染色檢測去細(xì)胞瓣

6、膜和天然瓣膜中異種抗原α-Gal和MHC I，評價不同去細(xì)胞方法對其去除效果。將去細(xì)胞瓣膜和天然瓣膜分別與人血孵育，ELISA法檢測PMN彈性蛋白酶和SC5b-9水平，評價不同去細(xì)胞方法處理的瓣膜體外對白細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)激活的影響。結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果顯示天然瓣膜中存在異種抗原α-Gal和MHC I；HSA不能有效去除瓣膜中的α-Gal和MHC I；LSA和SHLS可完全去除該兩種抗原；TSI可以去除MHC I，但不能完全去除α-Gal

7、。與人血孵育后，LSA和SHLS去細(xì)胞瓣組PMN彈性蛋白酶水平顯著低于HSA、TSI去細(xì)胞瓣組和天然瓣膜組；而HSA和TSI去細(xì)胞瓣組PMN彈性蛋白酶水平與天然瓣膜組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在四種去細(xì)胞瓣膜和天然瓣膜間，SC5b-9水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：SHLS和LSA去細(xì)胞方法可有效去除豬主動脈瓣中的異種抗原α-Gal和MHC I，其處理的瓣膜在體外能降低白細(xì)胞激活。
　　第二節(jié)：基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣

8、體外生物相容性的影響
　　目的：分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為組織工程瓣膜的種子細(xì)胞，探討基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法處理的瓣膜對細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性以及血液相容性的影響，并與經(jīng)典去細(xì)胞方法比較。
　　方法：采用全骨髓差異貼壁法，從Sprague Dawley大鼠骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs。光鏡下觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志物，成骨、成脂誘導(dǎo)體系分別誘導(dǎo)BMSCs定向分化。將BMS

9、Cs種植于不同去細(xì)胞方法處理的瓣膜上，在細(xì)胞種植后2 h和24 h以WST-8法測定各組瓣膜上的細(xì)胞粘附率。在細(xì)胞種植后2 d、4 d和8 d，以WST-8法測定各組瓣膜上的細(xì)胞增殖數(shù)，并以乳酸脫氫酶（LDH）法檢測各組瓣膜的細(xì)胞毒性。將新鮮人血與各組瓣膜孵育進(jìn)行溶血試驗，檢測各組瓣膜的溶血率。
　　結(jié)果：成功分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，第3代BMSCs在光鏡下呈梭形貼壁生長，形態(tài)均一，呈放射狀規(guī)則排列。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示BMSCs表

10、達(dá)特異性表面標(biāo)記物CD90和CD29，不表達(dá)CD45，表明均質(zhì)性好，表型穩(wěn)定；成骨和成脂體系誘導(dǎo)2 w后分別行茜素紅染色和油紅O染色呈陽性，表明分離的BMSCs具有多向分化潛能。BMSCs種植后2 h和24 h，四種去細(xì)胞瓣膜上細(xì)胞粘附率顯著高于天然瓣膜，且SHLS去細(xì)胞瓣膜表面細(xì)胞粘附率顯著高于HSA、LSA和TSI去細(xì)胞瓣膜。BMSCs種植后2 d，四種去細(xì)胞瓣膜上細(xì)胞相對增殖率均顯著高于天然瓣膜上細(xì)胞相對增殖率；BMSCs種植后4

11、 d和8 d，四種去細(xì)胞瓣膜上細(xì)胞相對增殖率仍顯著高于天然瓣膜上細(xì)胞相對增殖率，且SHLS去細(xì)胞瓣膜上細(xì)胞相對增殖率顯著高于HSA、LSA和TSI去細(xì)胞瓣膜。BMSCs種植后2 d，TSI去細(xì)胞瓣的細(xì)胞毒性顯著高于其他組，HSA、LSA和SHLS去細(xì)胞瓣膜的細(xì)胞毒性與天然瓣膜差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TSI去細(xì)胞瓣的溶血率亦顯著高于HSA、LSA、SHLS去細(xì)胞瓣膜和天然瓣膜。
　　結(jié)論：分離培養(yǎng)的BMSCs可作為組織工程瓣膜種子細(xì)胞。在

12、四種去細(xì)胞瓣膜中，BMSCs在SHLS去細(xì)胞瓣膜表面粘附增殖良好，且SHLS去細(xì)胞瓣膜對細(xì)胞毒性小、溶血率低。
　　第三部分基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法對豬主動脈瓣體內(nèi)組織重塑與鈣化的影響
　　目的：探討基于蛋白溶解的去細(xì)胞方法處理豬主動脈瓣植入體內(nèi)后的炎癥反應(yīng)、組織重塑與鈣化，與經(jīng)典去細(xì)胞瓣膜、天然瓣膜和戊二醛（GA）交聯(lián)瓣膜比較，并探討巨噬細(xì)胞極化在此過程的作用。
　　方法：72只雌性大鼠隨機(jī)分為6組，建立腹壁缺損模型

13、，應(yīng)用各組瓣膜對腹壁缺損進(jìn)行修補(bǔ)。于術(shù)后2 w和6 w取出植入物，行HE和Masson染色觀察炎癥反應(yīng)、組織降解、纖維包裹等并進(jìn)行組織學(xué)評分；硝酸銀染色和鈣含量檢測各組瓣膜鈣化情況；行免疫熒光和免疫組化染色比較不同處理方法植入物中巨噬細(xì)胞的表型變化；RT-PCR檢測促炎因子（IL-12、TNF-α、IL-6、IL-1β）、抗炎因子（IL-10、IL-1ra）、巨噬細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)（iNOS、ARG）、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑（MMP1、MM

14、P2、MMP9、TIMP1、TIMP2）在不同時間點(diǎn)、不同植入物中的基因表達(dá)水平；原位明膠酶譜法熒光染色檢測MMP2和MMP9活性。
　　結(jié)果：組織學(xué)分析結(jié)果顯示LSA和SHLS去細(xì)胞瓣膜在體內(nèi)進(jìn)行了較好的組織重塑，表現(xiàn)為植入物大量降解，原組織結(jié)構(gòu)不明顯，較為規(guī)則的ECM形成，組織中央可見肌細(xì)胞；HSA和TSI去細(xì)胞瓣膜在體內(nèi)組織重塑較差，表現(xiàn)為植入物內(nèi)和植入物周圍細(xì)胞浸潤減少，支架部分降解，ECM部分形成，肌細(xì)胞生長較少；天然瓣

15、膜和GA交聯(lián)瓣膜在體內(nèi)以異物反應(yīng)為主，表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤，無肌細(xì)胞生長，組織結(jié)構(gòu)基本完整，被致密的纖維組織包裹。植入體內(nèi)6 w后，硝酸銀染色顯示僅GA交聯(lián)瓣膜中可見大量褐黑色沉淀物；鈣含量檢測結(jié)果顯示四種去細(xì)胞瓣膜中的鈣含量均顯著低于天然瓣膜和GA交聯(lián)瓣膜。組織重塑較好的植入物（LSA和SHLS去細(xì)胞瓣膜） M2：M1巨噬細(xì)胞比率在不同時間點(diǎn)均高于組織重塑較差的植入物（HSA和TSI去細(xì)胞瓣膜）和發(fā)生異物反應(yīng)的植入物（天然瓣膜和GA

16、交聯(lián)瓣膜），而且HSA和TSI去細(xì)胞瓣膜的M2：M1巨噬細(xì)胞比率在不同時間點(diǎn)亦高于天然瓣膜和GA交聯(lián)瓣膜的。在植入體內(nèi)后2 w和6 w，抗炎因子在LSA和SHLS去細(xì)胞瓣中表達(dá)較高，而促炎因子在天然瓣膜和GA交聯(lián)瓣膜中表達(dá)較高。四種去細(xì)胞瓣膜植入體內(nèi)后，MMPs和TIMPs在2 w時表達(dá)較低，在6 w時表達(dá)較高。LSA和SHLS去細(xì)胞瓣膜植入體內(nèi)后，MMPs和TIMPs的表達(dá)水平在6 w顯著高于其他四組。GA交聯(lián)瓣膜植入體內(nèi)后，MMPs