Stanford A型主動脈夾層管壁生物力學(xué)及彈力纖維相關(guān)蛋白表達(dá)情況的研究.pdf

1、StanfordA型胸主動脈夾層(Thoracic Aortic Dissection，TAD)系主動脈血流經(jīng)內(nèi)膜破口沿管壁中層剝離，病變累及升主動脈以及主動脈弓部，并可累及全主動脈。從生物力學(xué)的觀點(diǎn)看來，StanfordA型TAD的發(fā)生系主動脈管壁所承受的管腔內(nèi)血流沖擊應(yīng)力超過了其機(jī)械強(qiáng)度的極限所致。雖然臨床上常以TAD患者發(fā)生夾層處主動脈的管腔最大直徑作為粗略估計(jì)其破裂可能的一項(xiàng)指標(biāo)，但對TAD患者管壁各層的生物力學(xué)性質(zhì)做更為精確的

2、定量分析對于臨床上更好地判斷患者預(yù)后是很有必要的。然而，目前人體主動脈的力學(xué)研究數(shù)量仍很少，并多以腹主動脈瘤(Abdominalaorticaneurysm，AAA)或升主動脈真性動脈瘤為研究對象。由于動物實(shí)驗(yàn)表明主動脈管壁由近端至遠(yuǎn)端不同節(jié)段的力學(xué)性質(zhì)有較大差異，且TAD的病理生理過程和真性ATAA并不相同，因此StanfordA型TAD患者升主動脈管壁各層的力學(xué)性質(zhì)目前尚未明確。
　　 彈性纖維(Elasticfibers，

3、EF)是主動脈這類彈力型動脈細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)的最主要成分之一，占其干重的30％。既往研究表明EF和膠原纖維在主動脈的含量和相對比例是決定管壁力學(xué)特性的最主要因素。EF是與決定管壁極限應(yīng)力(FailureStress)的主要因素“膠原纖維”相對應(yīng)的一類ECM，其賦予了主動脈良好的可擴(kuò)張性和回坐力，決定了其順應(yīng)性和極限應(yīng)變(FailureStrain)能力。管壁中層彈力片層(elasticlame

4、llae)結(jié)構(gòu)的毀損和缺失是公認(rèn)的StanfordA型TAD特征性病理改變之一，因此，明確TAD發(fā)病后不同時(shí)期管壁EF的重構(gòu)情況對進(jìn)一步探究其力學(xué)性質(zhì)變化的潛在分子基礎(chǔ)具有重要意義，并可為篩選藥物保守A型夾層的潛在分子生物學(xué)靶點(diǎn)提供參考。然而，既往有關(guān)ECM及EF在TAD中的研究多從膠原/彈性蛋白酶及炎性反應(yīng)對ECM降解的角度展開，有關(guān)EF合成在TAD病理過程中作用的研究甚少。主動脈管壁具有生物力學(xué)功能的成熟EF的合成是一個(gè)由多種分子參

5、與，多步驟逐級調(diào)控的復(fù)雜過程。目前有關(guān)主動脈疾病中與EF的合成異常相關(guān)的研究多以AAA為研究對象，然而，由于主動脈由近心端向遠(yuǎn)端彈性/膠原纖維比例逐漸減低，且TAD的發(fā)病機(jī)制不同于TAA，因此在TAD病例中，升主動脈管壁EF的合成是否具有異常，并由此導(dǎo)致了力學(xué)性質(zhì)的變化，目前尚未明確合成的具體情況以及由此導(dǎo)致的力學(xué)性質(zhì)的改變目前尚未明確。
　　 綜上所述，我們在本課題中旨在通過：1、通過力學(xué)試驗(yàn)明確StanfordA型TAD患者

6、升主動脈管壁力學(xué)特性的變化情況，特殊染色明確A型夾層患者升主動脈管壁形態(tài)及成熟彈性纖維含量。2、通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段明確StanfordA型TAD發(fā)病后，升主動脈管壁各層組織中彈性纖維相關(guān)分子(Elastic-fibre-associatedmolecules，EFAM)的表達(dá)重構(gòu)情況，為探究TAD管壁力學(xué)特性改變的潛在分子基礎(chǔ)提供相關(guān)信息。
　　 第一部分，StanfordA型TAD升主動脈力學(xué)試驗(yàn)及管壁成熟彈性纖維的形

7、態(tài)學(xué)研究
　　 目的：1、明確StanfordA型TAD患者和正常人相比其升主動脈管壁力學(xué)特性的變化情況。2、明確TAD患者較之對照組升主動脈管壁成熟彈性纖維的密度及分布情況。
　　 方法：1、通過單軸拉伸試驗(yàn)實(shí)時(shí)記錄應(yīng)變.應(yīng)力曲線(Strain-stresscurve)，并根據(jù)獲得的高頻數(shù)據(jù)計(jì)算彈性模量-應(yīng)力曲線(Elasticmodulous-stresscurve)，由此獲得正常對照組及StanfordA型急、慢性

8、TAD患者升主動脈管壁內(nèi)中層、外膜及全層組織拉伸至毀損時(shí)的極限阿爾曼西應(yīng)變(FailureAlmansistrain，ef)、極限柯西應(yīng)力(FailureCauchystress，sf)、以及極限彈性模量(PeakElasticModulus，Mp)，并進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析對比組間差異。2、通過直線回歸分析sf和Mp之間的相關(guān)性，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。3、經(jīng)HE及VG染色明確各組標(biāo)本升主動脈管壁彈性、膠原纖維在各層的分布情況。
　　 結(jié)果：

9、1、急、慢性TAD患者管壁各層的ef在周向(Circumferential，CIRC)及縱向(Longitudinal，Long)均顯著低于對照組，而急、慢性TAD相比管壁各層在周、縱向ef均無顯著差異。2、急、慢性TAD患者單純分離的管壁內(nèi)中層或外膜組織在周、縱向的sf均顯著低于對照組。急、慢性TAD相比內(nèi)膜組織的sf在周、縱向均無顯著差異；而外膜顯示慢性TAD組的sf在周、縱向均顯著高于急性TAD。對于管壁全層組織，sf在周、縱向均

10、顯示僅急性TAD顯著低于對照組，而慢性TAD與對照組無顯著差異。3、彈性模量方面，分離的內(nèi)中層及外膜組織在周、縱向的Mp測試結(jié)果顯示：急、慢性TAD組均顯著低于對照組，而急、慢性TAD相比內(nèi)膜的Mp無顯著差異，外膜Mp則慢性組顯著高于急性組。對于全層組織，僅急性TAD患者的Mp低于對照組，慢性TAD與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并顯著高于急性TAD。4、各組人群內(nèi)中層和外膜組織力學(xué)差異的研究顯示，正常人和TAD患者升主動脈外膜組織的ef、s

11、f、Mp在周、縱向上均顯著高于各自的內(nèi)膜組織。各組的管壁力學(xué)特性在周、縱向上的差異性研究提示ef在這兩個(gè)方向無顯著差異，而sf和Mp則顯示周向顯著高于縱向。5、直線回歸分析顯示各組人群的各層組織其sf和Mp在周向及縱向均呈高度正相關(guān)性。6、形態(tài)學(xué)研究顯示TAD患者管壁特征性的彈性纖維結(jié)構(gòu)毀損，其含量顯著低于正常主動脈。
　　 結(jié)論：1、TAD患者升主動脈的極限擴(kuò)張力顯著低于正常主動脈，且急、慢性TAD相比，各層組織在周、縱向的可

12、擴(kuò)張性均無顯著差異。2、StanfordA型夾層主動脈管壁的力學(xué)強(qiáng)度顯著低于正常對照，但慢性TAD在管壁力學(xué)強(qiáng)度上有一定程度的代償，主要表現(xiàn)為外膜組織機(jī)械強(qiáng)度增加。3、外膜不論在TAD患者還是正常人，其相對于內(nèi)中層組織均是一可拉伸性能更好，且力學(xué)強(qiáng)度更大的結(jié)締組織。4、升主動脈在周向的機(jī)械強(qiáng)度要顯著大于縱向，但二者的可拉伸性能無顯著差異，提示升主動脈管壁在不同方向的力學(xué)特性存在一定差異。5、組織學(xué)顯示TAD患者管壁EF毀損嚴(yán)重，含量較正

13、常升主動脈減少。
　　 第二部分，StanfordA型TAD升主動脈管壁彈力纖維相關(guān)蛋白表達(dá)情況的研究
　　 目的：明確StanfordA型TAD發(fā)病后，升主動脈管壁各層組織EFAM的表達(dá)情況，為探究導(dǎo)致TAD升主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)變化的潛在ECM分子機(jī)制提供相關(guān)信息。
　　 方法：1、通過普通RT-PCR及實(shí)時(shí)定量RT-PCR明確各組人群升主動脈管壁各層組織中彈性蛋白原(Tropoelastin，TE)、微纖維相

14、關(guān)蛋白以及賴氨酰氧化酶同工酶-1(Lysyloxidaselike-1，Loxl-1)mRNA的表達(dá)含量。2、通過免疫組織化學(xué)染色行形態(tài)學(xué)研究明確上述EFAM分子對應(yīng)的蛋白在升主動脈管壁的分布定位情況。3、通過蛋白印跡(Westernblot)定量分析上述EFAM在正常人和TAD患者升主動脈管壁各層的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1、急、慢性TAD組管壁各層可溶性TE的mRNA及對應(yīng)蛋白均較對照組有顯著增加，且均以外膜增加更為顯著。急

15、、慢性TAD相比，急性TAD患者的TEmRNA含量更多，而在蛋白水平二組人群無顯著差異。2、急、慢性TAD患者管壁全層組織原纖維類分子在mRNA及蛋白水平的含量均不高于正常對照組。對于單純內(nèi)中層組織，TAD患者較之對照組此類蛋白表達(dá)亦無顯著增加。對于單純外膜組織，急、慢性TAD組Emilin-1，F(xiàn)ibulin-4、5以及MAGP-1的含量顯著高于對照組。3、成纖維細(xì)胞的標(biāo)記分子DDR-2染色顯示急、慢性TAD患者管壁各層陽性染色均高于

16、正常對照，并在外膜增加更為明顯。4、急、慢性TAD患者管壁各層中促進(jìn)TE交聯(lián)和EF成熟的關(guān)鍵酶Loxl-1的mRNA及蛋白含量均顯著低于對照組，且慢性TAD和急性組相比顯示了更低的表達(dá)含量。
　　 結(jié)論：TAD發(fā)病后，管壁彈性纖維相關(guān)蛋白的表達(dá)主要位于外膜，而內(nèi)中層組織則未表現(xiàn)出較為活躍的表達(dá)。從表達(dá)成份來看，參與成熟彈力纖維組裝的可溶性EFAM在TAD組呈現(xiàn)不平衡表達(dá)的情況，具體表現(xiàn)為無定形核心的主要成分TE較正常主動脈表達(dá)增