豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管的脫細(xì)胞研究及組織學(xué)和生物力學(xué)特征.pdf

1、全文分為二部分: 第一部分豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管脫細(xì)胞的研究及組織學(xué)特征心血管組織工程為研究理想的人工心臟瓣膜提供了一種新的方法。組織工程心臟瓣膜的研究目標(biāo)是生產(chǎn)一種在體循環(huán)系統(tǒng)植入后能在體內(nèi)生長(zhǎng)、修復(fù)、塑型，具有生命活力及沒(méi)有免疫反應(yīng)的心臟瓣膜。支架材料的選擇是心血管組織工程研究的重要內(nèi)容，它為替代的組織提供了一個(gè)臨時(shí)的載體。豬的主動(dòng)脈瓣的解剖學(xué)和組織學(xué)特點(diǎn)與人類心臟瓣膜相似，是天然生物源性的支架材料。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)天然生物源性的

2、支架研究限于肺動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管或主動(dòng)脈瓣葉，對(duì)主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用低濃度十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)脫去豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管的細(xì)胞成分及可溶性蛋白，并與Steinhoff的胰蛋白酶脫細(xì)胞的方法進(jìn)行比較。目的是探索一種理想的異種生物基質(zhì)的脫細(xì)胞方法，為組織工程心臟瓣膜的研究提供一種良好的天然生物源性的支架材料。 方法：(1)豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管的獲取及分組：豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管來(lái)源于本地

3、屠宰場(chǎng)。將豬心臟連同二尖瓣前葉及上方2.0cm左右的主動(dòng)脈完整切下，以冰保存，2小時(shí)內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行修剪。剔除周圍脂肪組織及瓣環(huán)周圍肌肉。用含抑肽酶(10KIU/ml)，EDTA(0.1％,w/v)，青霉素(100U/ml)，鏈霉素(100μg/ml)的無(wú)菌PBS溶液充分清洗，儲(chǔ)存于4℃新鮮的PBS液中，分組處理。A組：新鮮對(duì)照組；B組：0.1％SDS脫細(xì)胞組；C組：0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA脫細(xì)胞組。 (2)豬主動(dòng)

4、脈帶瓣導(dǎo)管的脫細(xì)胞處理：B組：豬主動(dòng)脈瓣置于低滲Tris-HCl緩沖液(0.01M，pH8.0)含0.1％EDTA(w/v)和抑肽酶(10KIU/ml)溶液中，4℃靜置14h。轉(zhuǎn)入0.1％SDS(w/v)等滲Tris-HCl(0.05M，pH8.0)溶液中24h；PBS溶液清洗；轉(zhuǎn)入DNase200μg/ml、RNase20μg/ml等滲Tris-HCl液中(0.05M，pH7.6)4h；PBS溶液洗滌。上述溶液均含EDTA(0.1％，

5、w/v)和抑肽酶(10KIU/m1)。所有步驟均在37℃恒溫，持續(xù)震蕩下進(jìn)行。C組：豬主動(dòng)脈瓣置于0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA的PBS溶液中24h；PBS溶液清洗；轉(zhuǎn)入DNase200μg/ml、RNase20μg/mlPBS溶液中4h；PBS溶液洗滌。所有步驟均在37℃恒溫，持續(xù)震蕩下進(jìn)行。 (3)試片檢測(cè)：分別取主動(dòng)脈壁和瓣葉進(jìn)行檢測(cè)。HE染色作組織學(xué)觀察；Ⅷ因子、a-actin分別檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞；Ⅰ型膠

6、原染色觀察膠原分布；掃描電鏡(SEM)觀察超微結(jié)構(gòu)；檢測(cè)組織中可溶性蛋白及Ⅰ型膠原蛋白含量。 結(jié)果：(1)瓣葉基質(zhì)的脫細(xì)胞：B組徹底脫去了瓣葉中的細(xì)胞成分，基質(zhì)中留下不連續(xù)的空洞，沒(méi)有細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留。免疫組化染色顯示膠原纖維完整，排列緊密。C組瓣葉中的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞基本脫去，Ⅰ型膠原染色膠原纖維排列疏松，可見(jiàn)纖維斷裂。(2)主動(dòng)脈壁脫細(xì)胞效果：HE染色顯示B組主動(dòng)脈壁的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞基本脫干凈，Ⅷ因子及a-actin

7、檢測(cè)無(wú)細(xì)胞存留。HE染色顯示C組主動(dòng)脈壁的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮下層的間質(zhì)細(xì)胞也已基本去掉，但中膜層仍有較多間質(zhì)細(xì)胞，Ⅷ因子檢測(cè)陰性，中膜層a-actin檢測(cè)陽(yáng)性。 (3)電鏡觀察：SEM顯示：B組主動(dòng)脈壁和瓣葉表面內(nèi)皮細(xì)胞幾乎完全脫落，膠原纖維排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯纖維斷裂。C組主動(dòng)脈壁和瓣葉表面內(nèi)皮細(xì)胞脫落不完全，呈局灶性脫落，膠原纖維排列緊密，可見(jiàn)部分纖維斷裂。 (4)組織生化含量測(cè)定：兩種脫細(xì)胞方法使瓣葉中的可溶性

8、蛋白含量(B組為35.83±3.07μg/mg干重瓣葉；C組為27.68±9.07μg/mg干重瓣葉)均明顯少于對(duì)照組(58.88±7.89μg/mg干重瓣葉)(P＜0.01)；兩種脫細(xì)胞方法使管壁中的可溶性蛋白含量(B組為15.91±4.30μg/mg干重管壁；C組為19.94±8.37μg/mg干重管壁)均明顯少于對(duì)照組(34.52±4.28μg/mg干重管壁)(P＜0.01)兩種方法之間比較無(wú)明顯差異(B與C比較，P＞0.05)。

9、兩種脫細(xì)胞方法均未減少瓣膜和主動(dòng)脈壁中Ⅰ型膠原蛋白的含量(與對(duì)照組比較，P＞0.05)；兩組方法之間比較也無(wú)差異(B與C比較，P＞0.05)。 結(jié)論：(1)SDS方案能幾乎完全脫去豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管中的細(xì)胞成分，而細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)得到了很好保存。 (2)0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA也能部分脫去豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管中的細(xì)胞成分，但對(duì)主動(dòng)脈壁的效果差，且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)有破壞作用。 第二部分脫細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣的生物力

10、學(xué)特征 本實(shí)驗(yàn)第一部分采用低濃度十二烷基硫酸鈉(SDS)脫豬主動(dòng)脈瓣的細(xì)胞成分，經(jīng)光鏡和電鏡及免疫組化監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示：主動(dòng)脈壁和瓣葉中的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞幾乎完全脫走，細(xì)胞外的基質(zhì)成分得到了很好保存。但經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)脫豬主動(dòng)脈瓣后的生物力學(xué)性能如何尚有待驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)將上述材料進(jìn)行單軸負(fù)荷拉斷實(shí)驗(yàn)，以觀察低濃度十二烷基硫酸鈉對(duì)豬主動(dòng)脈瓣的生物力學(xué)影響。 方法：(1)豬主動(dòng)脈帶瓣導(dǎo)管的制備及脫細(xì)胞處理：伺實(shí)驗(yàn)的第

11、一部分 (2)分組及實(shí)驗(yàn)：A組：新鮮對(duì)照未處理組；B組：0.1％SDS脫細(xì)胞組；將主動(dòng)脈壁橫向裁成20×5mm；瓣葉橫向裁成15×5mm，瓣葉徑向裁成10×5mm，進(jìn)行單軸負(fù)荷拉斷實(shí)驗(yàn)。 (3)試片檢測(cè)：分別觀察試片的熱皺縮溫度，組織含水量，極限抗張強(qiáng)度，斷裂伸長(zhǎng)率，膠原相斜率及組織的彈性模量。 結(jié)果：(1)熱皺縮溫度測(cè)定(n=6)：B組瓣葉熱皺縮溫度(68.60±1.14℃)與A組瓣葉(68.20±1.30℃)

12、比較無(wú)明顯變化(P＞0.05)；B組主動(dòng)脈壁熱皺縮溫度(68.00±1.00℃)與A組主動(dòng)脈壁(68.80±1.10℃)比較也無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 (2)組織含水量測(cè)定(n=6)：瓣葉：B組含水量(91.00±2.03％)較A組(89.26±1.16％)增高，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；主動(dòng)脈壁：B組(79.67±0.80％)較A組(75.78±0.62％)明顯增高，有顯著性差異(P＜0.01). (3)生物

13、力學(xué)測(cè)定：主動(dòng)脈壁(n=6)：B組極限抗張強(qiáng)度(1.24±0.22Mpa)明顯大于A組(0.85±0.17Mpa)(P＜0.01)；B組斷裂伸長(zhǎng)率(160±11％)與A組(170±41％)比較稍減小，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。瓣葉橫向(n=6)：B組極限抗張強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率、膠原相斜率及組織的彈性模量與A組比較均變化不大(P＞0.05)。瓣葉徑向(n=6)：B組極限抗張強(qiáng)度(2.94±0.67Mpa)大于A組(2.55±1.01M

14、pa)但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；B組斷裂伸長(zhǎng)率(24±5％)明顯小于A組(68±21％)(P＜0.01)；B組膠原相斜率(33.77±12.08vs20.30±4.51)(P＜0.05)及瓣葉的特征性彈性模量(7.62±2.18vs3.34±0.80)(P＜0.01)均顯著性大于A組。 結(jié)論：(1)低濃度十二烷基硫酸鈉處理豬主動(dòng)脈瓣后，其力學(xué)強(qiáng)度改善。但瓣葉的僵硬度增加，延展性降低。處理后的瓣葉更接近自然的組織?？梢詽M足組