山莓葉萜類和酚類物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性研究.pdf

1、山莓（Rubus corchorifoliusL.f.）屬薔薇科懸鉤子屬一種落葉灌木。山莓葉具有豐富的營養(yǎng)和保健作用。本文以山莓葉為研究對象，采用溶劑萃取、柱層析和結(jié)晶等分離純化的方法對山莓葉醇提物的乙酸乙酯萃取組分進行分離純化，并對分離純化的單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。采用MTT法對分離的化合物進行抗腫瘤活性檢測。采用流式細胞儀分析化合物對細胞周期、凋亡、細胞線粒體膜電位和鈣離子離濃度的影響；采用Western blot分析化合物對腫瘤細

2、胞蛋白的影響，采用iTRAQ標記定量蛋白組學技術(shù)研究新型二萜化合物作用HCT-116細胞后的蛋白組學的變化。
　　研究研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）山莓葉中萜類和酚類物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　通過溶劑萃取、常壓柱層析、中壓柱層析、薄層層析和結(jié)晶等分離純化方法，對山莓葉的乙醇提取物中乙酸乙酯萃取物進行分離純化。采用核磁（1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC）、質(zhì)譜、X-單晶衍射分析和文獻數(shù)據(jù)進行比對的方

3、法對分離的單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明：山莓葉乙酸乙酯萃取組份共分離純化出10個化合物，分別為：16β,17-二羥基-3-氧-貝殼杉烷（1），貝殼杉烷-3α,16β,17-三醇（2），對映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（3)，對映-貝殼杉-3α,16β,17-三醇（4），對映-貝殼杉-16α,17二羥基-2酮（5），對映-貝殼杉-16β,17,19-三醇-3-酮（6），對映-貝殼杉烷-2α,16β,17-三醇（7）

4、，2α、3β、23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（8），對羥基肉桂酸乙酯（9），阿魏酸乙酯（10）。其中2個新化合物為對映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（3）和對映-貝殼杉-16β,17,19-三醇-3-酮（6）。首次在山莓葉發(fā)現(xiàn)了16β,17?二羥基-3-氧-貝殼杉烷（1），貝殼杉烷?3α,16β,17?三醇（2）和對映-貝殼杉?3β,16β,17?三醇（4）3個化合物。首次研究了貝殼杉烷-3α,16β,17-三醇

5、（2），對映-貝殼杉-16α,17二羥基-2酮（5）和對映?貝殼杉烷?2α,16β,17-三醇（7）3個化合物的單晶結(jié)構(gòu)。
　?。?）山莓葉中10種單體化合物的抗腫瘤活性篩選及化合物4和8的作用機制研究
　　采用MTT法檢測了分離出的10個化合物對人肝癌細胞（HepG2）、乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、人胃癌細胞(SCG-7901)、人卵巢癌細胞（OVCAR3）和人結(jié)腸癌細胞(HCT-116)5種癌細胞的增殖抑制作用。

6、結(jié)果表明：化合物3、4和8對HCT-116細胞具有很好的抑制作用，其IC50分別是40.00±1.78μM、29.84±2.35μM和26.84±2.12μM?；衔?和10對HepG2抑制作用的IC50分別為28.17±1.20μM和26.2±2.1μM?；衔?0在6.25~100μM時對正常LO2細胞的生長增殖沒有明顯的抑制作用，而化合物9在濃度為50μM和100μM時對LO2細胞的抑制率分別為25％和20%?；衔?在6.25~

7、100μM對 CCD-18co細胞的生長沒有明顯的抑制作用;化合物4在6.25~100μM時對CCD-18co細胞和生長和增殖有輕微的抑制作用;化合物8在6.25~25μM時對CCD-18co細胞沒有明顯的抑制作用，而當濃度為100μM時對CCD-18co細胞生長增殖具有明顯的抑制作用。采用流式細胞儀和Western blot技術(shù)研究了化合物4和8的對HCT116細胞的作用機理,結(jié)果表明：化合物4和8通過阻滯細胞周期于G0/G1期、促進

8、細胞凋亡，并能從蛋白水平上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、p53蛋白的表達和下調(diào)促周期進程蛋白cyclin D1、p27、CDK2和CDK4的表達。
　?。?）山莓葉中阿魏酸乙酯誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡及作用機制研究
　　采用顯微鏡觀察、流式細胞術(shù)和Western blot等方法從細胞形態(tài)、細胞周期和細胞凋亡等方面研究阿魏酸乙酯（化合物10）對HepG2細胞的抑制作用及其作用機制。結(jié)果

9、表明：15~35μM阿魏酸乙酯作用HepG2細胞72h時,細胞數(shù)量減少，輪廓變圓，漂浮，具有濃度依賴性；而對正常肝細胞LO2沒有明顯毒性。阿魏酸乙酯作用后的HepG2細胞，經(jīng)過 DAPI染色后，與空白對照相比，細胞明顯皺縮變亮，部分凋亡細胞核還發(fā)生了裂解，程度隨濃度的增加而增加，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。阿魏酸乙酯作用后的HepG2細胞，經(jīng)過Annexin V-FITC/PI染色流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)其作用濃度為15μM和35μM，細胞凋亡率（

10、Annexin V-FITC+區(qū)）分別是空白對照組的1.6倍(從6.27%升至10.04%)和10倍(從6.27%升至62.95%)。阿魏酸乙酯能誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，并具有濃度依賴關(guān)系。阿魏酸乙酯作用HepG2細胞后，經(jīng)過PI染色，流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)阿魏酸乙酯對細胞周期具有阻滯作用,當其濃度為15~20μM可以阻滯細胞于G0/G1期；當濃度為25~35μM時，可以阻滯細胞于S期。阿魏酸乙酯可以降低HepG2細胞的線粒體膜電位，當其

11、濃度從15μM升至35μM時，其細胞線粒體膜電位從29 a.u下降到14.2 a.u，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。阿魏酸乙酯能提高HepG2細胞內(nèi)鈣離子的濃度，當濃度為15μM和35μM時分別是對照組3.0和4.5倍。Western blot實驗進一步證明阿魏酸乙酯作用HepG2細胞后能激活促凋亡蛋白cleaved PARP、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、p53、Bax和周期阻滯蛋白p21的表達，而抑制

12、促周期進程蛋白cyclin D1的表達。
　　（4）山莓葉中新型二萜化合物DEK誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡及作用機制研究
　　采用顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)，從細胞形態(tài)、細胞體膜電位、細胞內(nèi)鈣離子濃度等方面研究新型二萜化合物對映-貝殼杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮縮酮（簡稱DEK）對HCT116細胞凋亡特性及抗腫瘤機制研究。結(jié)果表明：DEK誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡主要是通過作用細胞的形態(tài)、促進細胞凋亡、降低細胞體膜電位并將

13、細胞周期阻滯在S期。iTRAQ標記定量蛋白組學技術(shù)分析檢測DEK作用HCT116細胞后細胞中蛋白分子表達量變化，共獲得有統(tǒng)計學意義差異蛋白120個(P<0.05），其中53個蛋白為表達量下調(diào)，67個蛋白表達量上調(diào)。與腫瘤有關(guān)的上調(diào)和下調(diào)差異蛋白主要參與了酶調(diào)節(jié)活性、電子傳遞功能、抗氧化活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性，細胞的代謝、細胞生理和應(yīng)激反應(yīng)等。差異蛋白主要作用結(jié)直腸癌通路、氧化磷酸化通路、細胞周期、p53通路和Wnt等通路，在這些通路中對