戊型肝炎規(guī)范化實驗室診斷模式的建立.pdf

1、目的：1.系統(tǒng)評估我國主流HEV抗原/抗體ELISA檢測試劑盒的診斷靈敏度、特異度及相互間結(jié)果符合度，形成可指導(dǎo)臨床實驗室應(yīng)用的HEV血清學(xué)檢測試劑盒的質(zhì)量報告，以規(guī)范戊型肝炎的實驗室診斷流程。2.設(shè)計出充分滿足臨床診斷靈敏度和特異度要求的能夠檢測HEV不同基因型病毒株的一步法熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-timeRT-PCR）檢測體系；并初步建立起HEV RNA考評血清盤和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用于評價HEV核酸檢測的質(zhì)量評估。3.建立起不依

2、賴特殊設(shè)備和專業(yè)人員操作的快捷高效檢測HEV RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)平臺。
　　方法:1.收集戊肝患者、健康體檢人群、風(fēng)濕免疫病患者及巨細胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清樣本，分別用萬泰、科華、貝爾、麗珠、新創(chuàng)HEV IgM和 IgG抗體檢測試劑盒對上述標(biāo)本進行平行檢測，以考察不同試劑盒各自的診斷靈敏度和特異度及相互間的結(jié)果符合率。2.用 HEV細胞培養(yǎng)上清液作為中和抗原，通過中和抑制實驗的方

3、法來驗證各HEV抗體檢測試劑盒間檢測結(jié)果不一致時是否為真陽性。3.在HEV ORF3高度保守區(qū)設(shè)計能檢測HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探針引物，建立起一步法(Real time RT-PCR)檢測體系；將擬擴增的HEV RNA目的基因片段構(gòu)建成質(zhì)粒，以建立HEV質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用于濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建；構(gòu)建HEV基因1-4型病毒株細胞培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)上清液通過陰性血清倍比稀釋的方式初步建立評價HEV RNA檢測的考評血清盤。4.在

4、HEV基因組保守區(qū)域內(nèi)的6個位點區(qū)域設(shè)計4條特異性引物,建立起適用于不同基因型HEV RNA檢測的一步法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)；采集臨床患者血清標(biāo)本和豬、兔糞便標(biāo)本分別用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nPCR)方法進行并行檢測，以驗證RT-LAMP方法的有效性；用其它病毒性肝炎病原體來驗證其特異性，通過陽性標(biāo)本HEV RNA梯度倍比稀釋的方式來驗證其靈敏度。
　　

5、結(jié)果:1.不同廠家HEV IgM抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果具有良好的一致性，診斷靈敏度普遍欠佳，均未超過85％，特異度很好，未在非戊肝患者人群中發(fā)現(xiàn)HEV IgM抗體陽性現(xiàn)象。2.不同廠家HEV IgG抗體檢測試劑盒在戊肝患者人群中檢測結(jié)果具有較好的一致性，診斷靈敏度較高(90%以上)，在非戊肝患者人群中，檢測結(jié)果有較大差異，以萬泰和科華為例，萬泰試劑盒在非戊肝患者人群中抗體陽性率在16.5%-31.9%之間，而科華陽性率僅為1.1%-3.

6、3%之間。3.通過中和抑制試驗未發(fā)現(xiàn)萬泰檢測試劑盒有假陽性現(xiàn)象，進一步說明了萬泰IgG抗體試劑盒檢測靈敏度較高，而其它幾種試劑盒容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。4. HEV抗原檢測試劑盒與IgM和IgG抗體檢測結(jié)果及HEV RNA檢測有很高的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)IgM和IgG抗體均陰性而HEV抗原陽性的病例。5.本研究建立了能夠高效擴增包含兔HEV病毒株在內(nèi)的基因1-4型HEV病毒株的檢測，適用于血清和糞便等標(biāo)本，最低檢測限可達25copies/test

7、，較傳統(tǒng)RT-nPCR靈敏度高10倍以上；在103和106 copies/μl兩個濃度水平處，該方法批內(nèi)和批間精密度分別低于2%和3%，具有很好的重復(fù)性；經(jīng)臨床標(biāo)本驗證分析發(fā)現(xiàn)能夠用于戊肝患者及動物宿主的血清和糞便標(biāo)本檢測，且靈敏度顯著高于RT-nPCR。6.本研究構(gòu)建了HEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及HEV RNA考評血清盤，經(jīng)穩(wěn)定性驗證評估，能夠初步滿足臨床應(yīng)用需求。7.本研究成功構(gòu)建了適用于包含兔HEV在內(nèi)基因1-4型HEV RNA RT-LA

8、MP檢測方法。該方法最低檢測限度為5copies/test，顯著優(yōu)于RT-nPCR技術(shù)，略優(yōu)于Real time RT-PCR技術(shù)。與HAV,HBV和HCV患者血清標(biāo)本對無交叉反應(yīng)，特異度良好。233份血清或糞便標(biāo)本對該技術(shù)進行檢測效能驗證，并將該方法與Real time RT-PCR和RT-nPCR分別進行平行檢測。結(jié)果顯示RT-LAMP和Real time RT-PCR檢測陽性率顯著高于RT-nPCR，而兩者間檢測符合率高達92%，

9、未發(fā)現(xiàn)Real time RT-PCR或RT-nPCR檢測陽性而RT-LAMP檢測陰性的標(biāo)本。
　　結(jié)論：1.不同廠家HEV IgM抗體檢測試劑盒之間的檢測結(jié)果差異較小，對戊肝臨床診斷的靈敏度均在80%以上，特異性較高。HEV IgG抗體檢測試劑盒較 IgM檢測試劑盒更靈敏，但診斷特異度在不同廠家之間差異較大，經(jīng)綜合比較發(fā)現(xiàn)科華IgG抗體檢測試劑盒較適合于戊肝臨床診斷檢測，與IgM抗體檢測試劑盒配伍使用，能很好地彌補其靈敏度不足，

10、又能有效解決自身診斷特異度不足的問題。2.萬泰IgG抗體試劑盒較其它3種廠家靈敏度最高，更加適合于流行病學(xué)調(diào)查，鑒于科華試劑盒較低的檢測靈敏度，不適合應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。3.HEV抗原檢測試劑盒與HEV RNA檢測有很好的相關(guān)性，雖然其出現(xiàn)最早，能有效縮短HEV感染的檢測窗口期，但鑒于戊肝的發(fā)病特點，當(dāng)患者有癥狀就醫(yī)時抗體往往已經(jīng)出現(xiàn)，因此HEV抗原檢測在臨床應(yīng)用中的價值仍需進一步研究，本研究未發(fā)現(xiàn)其能提高HEV感染診斷效率的證據(jù)。4.

11、本研究建立了能夠高效擴增包含兔HEV病毒株在內(nèi)的基因1-4型HEV病毒株的HEV RNA一步法Real time RT-PCR檢測體系，適用于血清和糞便等標(biāo)本的檢測，具有檢測靈敏度、特異性高，重復(fù)性好等特點，值得進一步優(yōu)化后進行商品化嘗試。5.本研究構(gòu)建了Realtime RT-PCR所需的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品易制備、易精確定量，儲存條件簡單，穩(wěn)定性好。解決了HEV RNAReal time RT-PCR檢測臨床實驗室推廣應(yīng)用的瓶頸。6

12、.本研究初步制備了HEV RNA檢測考評血清盤，對Real-time RT-PCR檢測HEV RNA的臨床推廣所面臨的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果可控可比的問題進行了初步探索。該血清盤目前針對我國HEV感染人群和動物宿主中主要基因型(基因4型)的特點而制備，未來仍需進一步完善豐富其覆蓋的基因型別。7.本研究初步建立了RT-LAMP技術(shù)檢測HEV RNA的新方法，在特異度、靈敏度和臨床標(biāo)本檢測驗證中表現(xiàn)出了良好效果。該方法不需要昂貴的設(shè)備和繁瑣的電泳分析