異歐前胡素對(duì)體外人表皮黑素細(xì)胞中干細(xì)胞因子誘導(dǎo)的黑素生成的抑制作用研究.pdf

1、目的：研究發(fā)現(xiàn)，某些色素性疾病如色素性蕁麻疹，白癜風(fēng)的發(fā)生都與干細(xì)胞因子(Stem cell factor,SCF)/KIT的代謝有關(guān)。白芷是一種常用的治療色素性疾病的中藥，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，白芷提取物能夠抑制黑素合成，但白芷具體活性成分的作用機(jī)理目前還不明確。異歐前胡素是中藥白芷的重要藥理活性成分之一，由于其多種生物學(xué)活性，越來(lái)越引起人們的注意。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究異歐前胡素對(duì)由SCF誘導(dǎo)的體外人表皮黑素細(xì)胞黑素合成的影響，為以異歐前胡

2、素為重要藥理成分的中藥在治療色素性皮膚病的應(yīng)用方面提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：體外分離、純化培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞。通過(guò)MTT法測(cè)定不同濃度SCF對(duì)黑素細(xì)胞活力的影響、western blot方法檢測(cè)不同濃度SCF對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶蛋白(TYR)的表達(dá)影響篩選最適SCF應(yīng)用濃度。將體外培養(yǎng)純化的黑素細(xì)胞隨機(jī)分為6組：1.空白對(duì)照組，2.10nM SCF組，3.25μM異歐前胡素組，4.25μM異歐前胡素+10nM SCF組，5.50μM

3、異歐前胡素組，6.50μM異歐前胡素+10nM SCF組，各組按相應(yīng)條件分別作用黑素細(xì)胞48h后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：各組黑素細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察；檢測(cè)各組黑素細(xì)胞活力；測(cè)定和分析各組細(xì)胞TYR的活性和黑素含量的變化；檢測(cè)各組黑素細(xì)胞c-KIT、TYR、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TYRP-1)、Rab27a蛋白表達(dá)情況的變化；檢測(cè)各組黑素細(xì)胞TYR mRNA，Rab27a mRNA的表達(dá)；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組c-KIT、TYR分布及表達(dá)的影響；透射電

4、鏡觀察25μM異歐前胡素組作用黑素細(xì)胞前后，黑素細(xì)胞中黑素小體的數(shù)量，分布的超微結(jié)構(gòu)變化情況；MicroRNA芯片技術(shù)檢測(cè)比較25μM異歐前胡素作用前、作用48h后對(duì)黑素細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的影響。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的SCF(0-40nM)均可促進(jìn)黑素細(xì)胞的活力和TYR蛋白的表達(dá)，在該范圍內(nèi)，SCF在濃度為10nM條件下促進(jìn)黑素細(xì)胞活力以及TYR蛋白表達(dá)的作用最強(qiáng)。
　　2.在選擇的異歐前胡素濃度條件

5、下，異歐前胡素對(duì)SCF誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞的活力、TYR活性、黑素合成、c-KIT、TYR、TYRP-1蛋白的表達(dá)、TYR mRNA的表達(dá)有抑制作用，并呈劑量依賴性，而異歐前胡素對(duì)SCF誘導(dǎo)的Rab27a蛋白的表達(dá)、Rab27a mRNA的表達(dá)有促進(jìn)作用，并呈劑量依賴性。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示，異歐前胡素對(duì)c-KIT蛋白的定位沒(méi)有明顯影響，但c-KIT蛋白的熒光強(qiáng)度有所降低，并呈劑量依賴性。而異歐前胡素可影響TYR蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位

6、并抑制TYR蛋白的表達(dá)。
　　4.透射電鏡觀察黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，25μM異歐前胡素作用黑素細(xì)胞48h后，黑素細(xì)胞黑素體減少，黑化程度降低；并且空白對(duì)照組黑素小體分布在細(xì)胞核和細(xì)胞膜附近，而25μM異歐前胡素作用黑素細(xì)胞48h后，黑素小體分布向細(xì)胞膜靠近。
　　5. MicroRNA芯片分析比較異歐前胡素作用人表皮黑素細(xì)胞前后microRNA表達(dá)譜的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，25μM異歐前胡

7、素作用黑素細(xì)胞48h后，上調(diào)的microRNA共有52個(gè)，下調(diào)的microRNA共有16個(gè)。其中上調(diào)差異倍數(shù)大于等于1的共有6個(gè)，分別是hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-3178、hsa-miR-320a、hsa-miR-23b-3p；下調(diào)差異倍數(shù)小于等于-1的共有7個(gè)，分別是hsa-miR-4259、hsa-miR-4451、hsa-miR-3177-3p、hsa

8、-miR-363-5p、hsa-miR-4638-5p、hsa-miR-1247-3p、hsa-miR-4521。通過(guò)對(duì)這些上調(diào)和下調(diào)的microRNAs靶基因的Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)，其中，上調(diào)microRNAs的生物過(guò)程主要是對(duì)非生物刺激的反應(yīng)，運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)，RNA代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)，細(xì)胞器的調(diào)節(jié)，激酶活性的調(diào)節(jié)；分子功能主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子活性和轉(zhuǎn)錄因子活性。下調(diào)microRNAs的生物過(guò)程主要是微管聚合或解聚過(guò)程的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

9、，細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和微管參與過(guò)程的調(diào)節(jié)；分子過(guò)程主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子活性，微管蛋白結(jié)合，細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，微管結(jié)合，DNA結(jié)合和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄子活性。
　　結(jié)論：
　　1.異歐前胡素通過(guò)抑制TYR活性、c-KIT蛋白、TYRP-1蛋白、TYR蛋白、TYR mRNA表達(dá)，從而抑制人表皮黑素細(xì)胞中SCF誘導(dǎo)的黑素合成。
　　2.異歐前胡素通過(guò)促進(jìn)Rab27a蛋白以及Rab27a mRNA的表達(dá)，促進(jìn)黑素小體、TYR的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)影