楊梅素及楊梅提取液對體外人黑素細胞黑素體生成和轉(zhuǎn)運的作用.pdf

1、[目的]
　　楊梅中含有多種黃酮類化合物，從楊梅中分離、提純得到的黃酮類化合物楊梅素(Myricetin，MYR)。近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化性、消除體內(nèi)自由基、抗癌防癌、抗菌抗病毒、抗炎、防止血小板聚集等多種生物活性。但其對正常人黑素細胞的影響卻鮮有報道。在黑素運輸阻斷劑的篩選中，我們發(fā)現(xiàn)楊梅素能夠誘導(dǎo)正常人表皮黑素細胞的形態(tài)變化，抑制黑素細胞樹突延伸。黑素在黑素細胞內(nèi)合成后，經(jīng)由黑素細胞樹突分泌入周邊角質(zhì)化細胞內(nèi)，形成皮膚色素并保

2、護機體免受紫外線損傷，因此黑素轉(zhuǎn)運率是影響膚色的重要因素。此過程受樹突長短、樹突分叉的數(shù)量及胞內(nèi)外環(huán)境的影響。本研究旨在評價楊梅單體楊梅素及楊梅提取液對正常人表皮黑素細胞的細胞形態(tài)和增殖的影響，并闡明楊梅單體楊梅素及楊梅提取液對于人表皮黑素細胞黑素體合成與轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　[方法]
　　采用M254黑素細胞培養(yǎng)基及添加劑HMGS培養(yǎng)和純化人表皮黑素細胞；使用原子吸收光譜法測定新鮮楊梅的成分；醇提取法提取楊梅的活性成分；

3、觀察楊梅素及楊梅提取液對正常人黑素細胞的增殖和黑色素生成方面的調(diào)節(jié)作用；分別采用常規(guī)制樣方法和以PET聚酯薄膜為培養(yǎng)細胞的支持物制備透射電鏡樣本，并通過透射電鏡觀察楊梅素及楊梅提取液對黑素細胞超微結(jié)構(gòu)的影響；激光共聚焦顯微鏡觀察楊梅素及楊梅提取液對黑素細胞相關(guān)蛋白Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和β-actin的表達的變化；實時定量PCR檢測Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和Rab27a在基因水平

4、上的表達的變化。
　　[結(jié)果]
　　1.本研究成功分離及純化了人表皮黑素細胞，完善了人表皮黑素細胞體外培養(yǎng)條件。
　　2.原子吸收光譜方法測定楊梅的化學(xué)元素含量。
　　3.楊梅素對黑素細胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用；楊梅素作用組黑素細胞樹突明顯變短，樹突分叉減少，且呈濃度依賴性。楊梅提取液對黑素細胞樹突增生有一定的促進作用。
　　4.人表皮黑素細胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，常規(guī)制樣標本可觀察人表皮黑素細胞及其

5、樹狀突起橫切面的超微結(jié)構(gòu)。PET聚酯薄膜作為培養(yǎng)黑素細胞支持物的樣本可觀察人表皮黑素細胞和樹狀突起的完整超微結(jié)構(gòu)及樹狀突起的縱切面超微結(jié)構(gòu)。
　　5.透射電鏡結(jié)果顯示，Control組黑素細胞細胞核周圍有較多的線粒體和Ⅰ、Ⅱ期黑素體，較多黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素體靠近細胞膜分布。50μM楊梅素作用48 h后黑素細胞細胞核周圍有較多的線粒體和Ⅰ、Ⅱ期黑素體，僅有少量黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素體散在分布于細胞中。與Control組黑素細胞相比，楊梅

6、提取液組黑素細胞的超微結(jié)構(gòu)未見明顯變化。
　　6.激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，Control組黑素細胞Tyrosinase和TRP-1蛋白在樹突頂端高表達；50μM楊梅素組，Tyrosinase和TRP-1蛋白在細胞內(nèi)散在分布，與Control相比，Myosin Va蛋白在黑素細胞內(nèi)表達下降。楊梅提取液組與Control組相比，黑素細胞內(nèi)Myosin Va蛋白的表達無明顯變化。
　　7.實時PCR檢測發(fā)現(xiàn)，隨著楊梅素作用濃度的

7、增加，Tyrosinase、TRP-1、Myosin Va和Rab27a mRNA的表達呈先激活后抑制作用。50μM楊梅提取液時作用黑素細胞48 h后，Tyrosinase和Rab27a mRNA的表達呈被抑制作用。
　　[結(jié)論]
　　1.成功建立了體外原代培養(yǎng)的人表皮黑素細胞模型。
　　2.0～100μM楊梅素可誘導(dǎo)黑素細胞形態(tài)明顯改變和抑制黑素細胞中黑素的合成，并且對黑素細胞無毒性。0～400μM楊梅提取液對黑素細

8、胞無毒性。
　　3. PET聚酯薄膜可作為人表皮黑素細胞體外培養(yǎng)良好的支持材料。應(yīng)用不同樣本制備方法可以觀察黑素細胞的超微結(jié)構(gòu)，使用PET聚酯薄膜作為細胞支持物制備的標本更利于黑素細胞黑素體代謝和轉(zhuǎn)移的觀察。
　　4.電鏡觀察結(jié)果顯示，楊梅素作用組黑素細胞黑素體的轉(zhuǎn)運被抑制，黑素化程度降低。而楊梅提取液組黑素細胞無明顯變化。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示楊梅素作用組黑素細胞Tyrosinase和TRP-1蛋白定