TPA誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞參與表皮和毛囊再著色的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.探討TPA能否活化毛囊bulge-次級毛芽處的黑素干細(xì)胞參與表皮再次著色、再生毛囊的著色，為臨床上治療皮膚和毛囊色素缺失性疾病提供新的重要參考依據(jù);
　　2.探討TPA能否通過調(diào)控SCF/c-kit信號誘導(dǎo)黑素干細(xì)胞向表皮遷移并參與表皮的再次著色;
　　3.探討TPA能否通過Wnt/β-catenin信號活化黑素干細(xì)胞，并誘導(dǎo)它們參與毛發(fā)著色。
　　材料方法:
　　1.將TPA或者丙酮涂抹在

2、7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮膚上，利用H&E、Masson Fontana染色檢測表皮的著色情況，利用L-DOPA法檢測催化TYR(黑素合成的關(guān)鍵酶)在皮膚內(nèi)的活性;利用免疫熒光檢測表皮和毛囊中DCT、TYR以及MITF的表達(dá);利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記DCT與PCNA來檢測黑素干細(xì)胞和黑素祖細(xì)胞的增殖情況;利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記DCT與MITF并結(jié)合皮膚的著色情況來分析TPA處理后黑素譜系細(xì)胞在毛囊和表皮中分布的差異情況。<

3、br>　　2.利用創(chuàng)傷愈合實驗、Transwell實驗檢測不同濃度的TPA對黑素母細(xì)胞系iMC23細(xì)胞遷移的影響;利用TPA處理的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞JB6 cl30-7b，并用Transwell技術(shù)檢測處理過的JB6 cl30-7b能否增強(qiáng)iMC23的遷移;用NaOH法檢測不同濃度的TPA對iMC23細(xì)胞黑素生成的影響，用L-DOPA法檢測TPA處理的iMC23細(xì)胞內(nèi)TYR活性的變化，并利用western blot和免疫熒光檢測控制黑素生

4、成的關(guān)鍵酶-DCT、TRP1、TYR的表達(dá)。
　　3.利用免疫熒光分別檢測SCF和c-kit在TPA或丙酮處理的小鼠背部皮膚中的表達(dá)，利用qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)檢測TPA處理的皮膚以及JB6 cl30-7b細(xì)胞中SCF mRNA的表達(dá)，利用western blot檢測c-kit在TPA處理的iMC23細(xì)胞中的表達(dá);<

5、br>　　4.皮內(nèi)注射抗c-kit抗體(ACK2)阻斷SCF/c-kit信號后，利用H&E染色、MassonFontana染色檢測ACK2對TPA誘導(dǎo)的表皮著色的影響，利用L-DOPA法進(jìn)一步檢測處理后的皮膚內(nèi)TYR活性的變化，再利用免疫熒光檢測黑素細(xì)胞標(biāo)記物DCT、TYR、MITF的表達(dá);
　　5.利用ACK2抑制SCF/c-kit信號后，采用Transwell技術(shù)檢測TPA處理的JB6 cl30-7b細(xì)胞對iMC23細(xì)胞遷移的

6、誘導(dǎo)能力是否會發(fā)生變化。
　　6.將TPA或者丙酮涂抹在7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮膚上誘導(dǎo)毛囊再生成，利用H&E染色、Masson Fontana染色檢測TPA誘導(dǎo)的毛囊、丙酮處理的毛囊以及正常生長期Ⅵ期的毛囊之間著色的差異，利用免疫熒光技術(shù)檢測黑素細(xì)胞標(biāo)記物DCT、TRP1、TYR、MITF在各組之間的表達(dá)差異。
　　7.用免疫熒光檢測各組毛囊中DCT和BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine，5

7、-溴脫氧尿嘧啶核苷)的共表達(dá)，用來反映黑素干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖情況;利用免疫熒光標(biāo)記MITF和BrdU，用于檢測黑素祖細(xì)胞在各組毛囊中的增殖情況。
　　8.用免疫熒光檢測Wnt/β-catenin信號關(guān)鍵分子β-catenin在各組毛囊內(nèi)的黑素譜系細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在檢測Wnt/β-catenin信號在各組毛囊中的活化情況。
　　9.在TPA處理的背部皮膚內(nèi)注射Dickkopf1(DKK1)或N1質(zhì)粒，利用免疫熒光檢測綠色

8、熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，再用免疫熒光檢測核β-catenin在各組毛囊中的表達(dá)以驗證DKK1對TPA活化的Wnt/β-catenin信號的抑制情況;利用H&E染色和MassonFontana染色對比DKK1+TPA處理的毛囊、N1+TPA處理的毛囊以及生長期Ⅵ期毛囊的著色情況;利用免疫熒光對比黑素細(xì)胞標(biāo)記物在各組毛囊中的表達(dá)情況。
　　10.利用免疫熒光標(biāo)記DCT和BrdU、標(biāo)記MITF和BrdU在各組毛囊中的分布情況，反映DK

9、K1對TPA活化的黑素干細(xì)胞、黑素祖細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:
　　1.TPA處理顯著增加了表皮的厚度，處理2次后伴隨著皮膚內(nèi)TYR活性增加，表皮著色開始增加;免疫熒光的結(jié)果顯示在TPA處理2次后DCT、TYR和MITF表達(dá)在毛囊漏斗部和表皮中，而在TPA處理1次后DCT就在毛囊bulge-次級毛芽處增加;在TPA處理1次（包括2次、4次）后毛囊bulge-次級毛芽處的DCT陽性的黑素干細(xì)胞表達(dá)PCNA;不產(chǎn)黑素顆粒的DCT+

10、MITF-的黑素干細(xì)胞出現(xiàn)在毛囊漏斗部而產(chǎn)黑素顆粒的成熟黑素細(xì)胞出現(xiàn)在表皮。這些結(jié)果說明黑素干細(xì)胞能直接遷出毛囊bulge-次級毛芽并在遷往表皮的過程中開始分化、生產(chǎn)黑素顆粒。
　　2.TPA能顯著的增強(qiáng)iMC23細(xì)胞的遷移;TPA處理的JB6 cl30-7b細(xì)胞也能顯著的增加iMC23細(xì)胞的遷移;TPA以濃度依賴性促進(jìn)iMC23細(xì)胞內(nèi)黑素顆粒的生成，以濃度依賴性和時間依賴性增強(qiáng)iMC23細(xì)胞內(nèi)TYR活性;TPA處理顯著的增加了i

11、MC23細(xì)胞內(nèi)DCT、TRP1和TYR的表達(dá)。
　　3.TPA處理1次顯著促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)SCF，但是沒有誘導(dǎo)c-kit的表達(dá)，在TPA處理2次后c-kit才在表皮和毛囊漏斗部表達(dá);TPA處理能顯著增加皮膚中SCFmRNA的表達(dá)以及JB6 cl30-7b細(xì)胞中SCF mRNA的表達(dá);TPA處理iMC23細(xì)胞3h后c-kit的表達(dá)顯著增加。
　　4.ACK2處理后，TPA誘導(dǎo)的表皮再次著色以及TPA增加的TYR活性都被

12、顯著抑制，但TPA增加的表皮厚度沒有受到影響;同時，DCT、TYR和MITF在TPA處理的毛囊漏斗部和表皮內(nèi)的表達(dá)被顯著抑制。這些結(jié)果提示，抑制SCF/c-kit信號阻止了毛囊黑素細(xì)胞向表皮遷移、減少了表皮的再次著色。
　　5.Transwell結(jié)果顯示，ACK2處理后TPA誘導(dǎo)iMC23細(xì)胞遷移的作用被抑制，經(jīng)TPA處理的JB6 cl30-7b細(xì)胞對iMC23細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)能力也被顯著抑制，該結(jié)果驗證了角質(zhì)形成細(xì)胞來源的SCF/

13、c-kit信號能顯著誘導(dǎo)黑素母細(xì)胞的遷移。
　　6.TPA處理小鼠背部皮膚4周后能顯著的誘導(dǎo)分化正常的毛囊再生，該毛囊的毛干、毛球部尺寸較正常生長期Ⅵ期毛囊的更大，毛母質(zhì)的著色更明顯，毛球部內(nèi)表達(dá)DCT、TRP1、TYR和MITF更多。
　　7.DCT和BrdU雙陽性細(xì)胞在TPA處理的毛囊bulge、毛母質(zhì)處顯著增加，MITF和BrdU雙陽性細(xì)胞在TPA處理的毛球部顯著增加，提示TPA顯著促進(jìn)了毛囊內(nèi)黑素干細(xì)胞、黑素祖細(xì)胞的

14、增殖。
　　8.在TPA處理的毛囊內(nèi)表達(dá)核β-catenin的黑素細(xì)胞數(shù)明顯增加，提示TPA顯著增加了Wnt/β-catenin信號在黑素細(xì)胞內(nèi)的活性。
　　9.在TPA處理并注射質(zhì)粒的皮膚內(nèi)，GFP明顯表達(dá)在毛囊、真皮和皮下組織中;DKK1顯著的抑制了TPA誘導(dǎo)的表達(dá)核β-catenin的黑素細(xì)胞數(shù)，表明DKK1轉(zhuǎn)染成功后抑制了TPA誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號。此外，DKK1控制了TPA對毛球部、毛干大小、毛母質(zhì)

15、著色的作用，抑制了DCT、TRP1、TYR和MITF在TPA處理的毛球部的表達(dá)，表明抑制Wnt/β-catenin信號后毛球部、毛干大小以及毛母質(zhì)著色恢復(fù)到相對正常的水平。
　　10.免疫熒光顯示DKK1顯著抑制了TPA增加的bulge和毛球部中DCT和BrdU雙陽性細(xì)胞數(shù)目，以及毛球部的MITF和BrdU雙陽性細(xì)胞數(shù)目，提示抑制Wnt/β-catenin信號能顯著抑制TPA促進(jìn)黑素干細(xì)胞和黑素祖細(xì)胞增殖的作用。
　　結(jié)論: