Notch信號通路靶基因HES1在膽道閉鎖中表達水平及意義的研究.pdf

1、目的:
　　分析臨床膽道閉鎖（Biliary atresia, BA）患兒肝組織中膽道上皮細胞的發(fā)育情況，并建立洹河猴輪狀病毒感染誘導的小鼠膽道閉鎖動物模型，利用這一模型來觀察Notch信號通路靶基因HES1與膽道上皮細胞發(fā)育的關系，從而探討HES1基因的表達在膽道閉鎖疾病中的意義。
　　方法:
　　1、收集臨床膽道閉鎖、膽總管囊腫、門靜脈海綿樣病變患兒肝組織標本，利用HE染色及免疫組化染色技術觀察肝組織中膽道上皮細胞

2、的發(fā)育情況，以及應用掃描電鏡的來觀察其超微結構。
　　2、制備輪狀病毒懸液，并測定其滴度達到1*107PFU，然后用出生24小時內的Balb/c乳鼠腹腔注射20ul的輪狀病毒液，制成膽道閉鎖動物模型，對照組僅注射病毒培養(yǎng)液，于第3、7、14、21天分別收取肝臟及肝外膽道組織。
　　3、利用H&E、免疫組化染色來觀察動物模型中膽道上皮細胞的發(fā)育，用RT-PCR檢測并篩選Notch信號通路相關基因在動物模型中的表達。
　　

3、4、用Western-blot、免疫組化等方法來在動物模型臨床病理標本中進行驗證。
　　結果:
　　1、CTPV組的肝組織可見膽道上皮細胞CK19強陽性，其膽管呈規(guī)則管狀，細胞形態(tài)結構正常；BA中膽道上皮細胞異常增生，大部分為EpCAM強陽性，無規(guī)則管狀結構，細胞形態(tài)結構畸形、紊亂。電鏡觀察結果與CC比較，在BA肝組織中可見膽管狹窄、閉塞，有膽鹽沉積，膽道細胞微絨毛的減少，細胞間隙增寬，緊密連接減少。
　　2、BA鼠肝

4、組織中免疫組化顯示膽道上皮細胞數(shù)量減少，且發(fā)育不成熟， RT-PCR和Western-blot結果顯示在第7天（p=0.00011）和14天（p=0.00016） Notch的靶基因HES1的表達持續(xù)下降。
　　3、免疫組化顯示HES1在BA患兒肝臟組織中成熟的膽管中表達較高，高于CC組，并且在同一BA切片中CK19陽性的成熟膽道上皮細胞表達多于EpCAM陽性的不成熟膽道上皮細胞。
　　4、BA及CC標本中纖維組織伴隨著Ep

5、CAM陽性不成熟細胞的增生而增多，并且在不同的肝纖維化分組中EpCAM陽性的不成熟膽道上皮細胞數(shù)量的表達是有差異的（r=0.56，P=0.00015）。
　　結論:
　　1、BA中異常增殖的膽道上皮細胞主要為發(fā)育不成熟的膽道上皮細胞。
　　2、Notch信號通路靶基因HES1在膽道閉鎖小鼠動物模型中表達下調，說明HES1可能參與了BA的形成。
　　3、HES1在不成熟膽道上皮細胞中表達下調，提示與膽道上皮細胞成熟