ANG-1在AS髖關節(jié)韌帶中表達增加并通過Notch信號通路調(diào)節(jié)血管再生.pdf

1、第一部分:強直性脊柱炎髖關節(jié)韌帶基質降解和血管生成增加
　　研究背景:強直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一種自身炎癥性疾病，炎癥常常累及中軸關節(jié)及外周大關節(jié)的肌腱韌帶附著點，晚期韌帶肌腱附著點部位易形成韌帶骨贅，而炎癥和新骨形成常伴發(fā)有血管再生。髖關節(jié)作為AS中最常受累的外周大關節(jié)，目前國內(nèi)外的研究中，還沒有關于AS髖關節(jié)韌帶中血管再生方面的研究。
　　研究目的:本部分實驗中，我們在手術的過

2、程中獲取AS和股骨頸骨折(FemurNeck Fracture，F(xiàn)NA)髖關節(jié)周圍韌帶分別作為實驗組和對照組，研究AS髖關節(jié)周圍韌帶是否伴發(fā)有血管再生增加。
　　實驗方法:血管周圍基質降解是血管再生的第一步。我們通過RT-PCR檢測纖連蛋白(fibronectin)，層黏連蛋白(Laminin)，1型膠原(Collagen1)，4型膠原(Collagen4)，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MM

3、P1，MMP2，MMP9)，基質金屬蛋白酶抑制劑(inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP1，TIMP2，TIMP3)表達水平的變化來證明血管周圍基質降解情況。CD31是血管內(nèi)皮細胞的表面標志物，F(xiàn)ibronectin和Laminin是能反應血管周圍基質降解情況，我們通過CD31與Fibronectin，CD31與Laminin雙標免疫熒光的方法來證明AS髖關節(jié)周圍基質降解，血管密度及其形

4、態(tài)的變化。
　　實驗結果:RT-PCR結果提示，與FNF髖關節(jié)韌帶對比，AS患者髖關節(jié)韌帶組織中MMP1，MMP2，MMP9表達分別增加7.21倍，2.17倍和2.19倍，而Fibronectin，Laminin，Collagen1，Collagen4，TIMP1，TIMP2，TIMP3表達分別降低1.92倍，2.44倍，2.04倍，2.63倍，2.33倍，10.73倍，2.78倍。雙標免疫熒光結果提示，與FNF相比，AS患者髖關

5、節(jié)韌帶組織血管密度增加，F(xiàn)ibronectin，Laminin表達水平明顯降低，這些結果證明在AS髖關節(jié)韌帶組織中血管周圍基質降解增加，血管再生增加。
　　結論:與FNF髖關節(jié)韌帶組織相比，AS髖關節(jié)韌帶組織中基質降解增加，血管再生增加。
　　第二部分:強直性脊柱炎髖關節(jié)韌帶組織及成纖維細胞中Ang1表達增加，TNF-γ刺激AS成纖維細胞后Ang1及Tie2表達增加
　　研究背景:血管再生過程中，許多細胞因子參與其中，

6、包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，成纖維細胞生長因子，血管生成素家族(Angiopoietins，Angs)及其受體等。本課題組之前的基因芯片結果已經(jīng)證實Angs家族中的Ang1在AS髖關節(jié)韌帶組織中表達上調(diào)。
　　研究目的:本部分實驗中，我們將進一步證明Ang1、Ang2、Tie2受體及CD31在AS髖關節(jié)韌帶組織中表達水平的變化，Ang1，Ang2在成纖維細

7、胞中表達水平的變化。TNF-α刺激成纖維細胞，探索引起AS中Ang1表達上調(diào)的原因。
　　實驗方法:首先，我們通過RT-PCR在基因水平檢測AS髖關節(jié)組織中Ang1，Ang2，Tie2表達水平的變化，通過Western-Blot在蛋白水平檢測AS測髖關節(jié)組織中Ang1，Ang2，Tie2表達水平的變化。通過免疫組化對Ang1，Ti2及CD31行半定量和定位檢測，通過CD31與Tie2雙標免疫熒光法定位Tie2表達部位。其次，獲取韌

8、帶組織后，膠原酶消化法獲取成纖維細胞，通過CD90和CD29鑒定成纖維細胞。通過RT-PCR和Western-Blot方法分別檢測AS成纖維細胞中Ang1，Ang2及Tie2在基因水平和蛋白水平的變化。通過Ang1與CD90雙標免疫熒光方法檢測AS成纖維細胞中Ang1表達變化，并對Ang1合成部位進行定位分析。通過ELISA的方法檢測成纖維細胞培養(yǎng)上清液中Ang1，Ang2濃度。最后，為了進一步探討引起AS成纖維細胞中Ang1表達上調(diào)的

9、原因，我們用TNF-α刺激成纖維細胞后檢測Ang1配體和Tie2受體的表達。
　　實驗結果:RT-PCR結果提示，與FNF的髖關節(jié)韌帶組織相對比，AS的髖關節(jié)韌帶組織中Ang1，Ang2，Tie2表達分別上調(diào)5.32倍，3.56倍和2.13倍。Western-Blot結果提示，AS髖關節(jié)韌帶組織中Ang1，Ang2，Tie2的表達增加，對其定量分析提示，AS髖關節(jié)韌帶組織中Ang1(P＜0.001)，Ang2(P＜0.001)，T

10、ie2(P＜0.001)蛋白的灰度值明顯高于FNF，而Ang1灰度值/Ang2灰度值的比值沒有差異。免疫組化的結果提示，AS髖關節(jié)韌帶組織中Ang1，CD31，Tie2蛋白表達均上調(diào)，Ang1蛋白在血管周圍及其遠離血管的部位均有表達，Tie2主要在血管周圍表達。CD31與Tie2雙標免疫熒光結果證實Tie2在主要在內(nèi)皮細胞上表達。細胞鑒定結果提示，膠原酶消化法獲得的細胞81.1％為成纖維細胞。成纖維細胞RT-PCR與Western-Bl

11、ot的結果提示，AS成纖維細胞中Ang1在基因水平及蛋白水平表達均上調(diào)。CD90與Ang1雙標免疫熒光結果提示Ang1在AS成纖維細胞胞漿中的表達明顯高于FNF，ELISA結果提示，AS成纖維細胞上清培養(yǎng)液中Ang1的濃度明顯高于FNF(36.3±5.08 ng/ml VS17.06±1.54 ng/ml，p＜0.001)。當用TNF-α刺激AS成纖維細胞后，Ang1以劑量依賴的方式表達上調(diào)，并且Ang1的受體Tie2也以劑量依賴的方式

12、表達上調(diào)，F(xiàn)NF成纖維細胞中未發(fā)現(xiàn)這種情況。
　　結論:與FNF相比，Ang1，Ang2，Tie2無論基因水平還是蛋白水平在AS髖關節(jié)韌帶組織中均表達增加。Tie2受體在AS髖關節(jié)韌帶組織中表達增加，并且主要在的內(nèi)皮細胞中表達。AS成纖維細胞中，Ang1在基因和蛋白水平均表達增加，由胞漿合成分泌至細胞外，通過旁分泌的方式作用在韌帶組織中的內(nèi)皮細胞上。TNF-α能刺激AS髖關節(jié)韌帶成纖維細胞，Ang1配體及Tie2受體表達上調(diào)，可能

13、與AS本身的炎癥性病理變化有關。
　　第三部分:AS成纖維細胞上清液及COMP-Ang1促進了內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成
　　研究背景:血管再生由血管周圍環(huán)境所決定，當周圍環(huán)境不能為組織提供足夠的營養(yǎng)物質和氧氣時，低氧組織就是釋放促血管再生因子，促使內(nèi)皮細胞從已有血管的上出芽形成新的血管。血管再生的過程中，血管周圍基質的降解是第一步，第一部分實驗已經(jīng)證實。隨后內(nèi)皮細胞從原有血管的上通過出芽，形成分枝，每一個新的出芽都會通過尖端

14、細胞與周圍的出芽連接起來，最終形成連續(xù)的管腔。血管再生是多基因共同作用的結果，那么，COMP-Ang1與成纖維細胞上清液能否促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成呢？
　　研究目的:本部分實驗的目的是檢測AS和FNF成纖維細胞細胞上清液中Ang1/Tie2信號系統(tǒng)是否能促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成，同時用Ang1的重組蛋白COMP-Ang1檢測其是否促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成，以驗證Ang1促進血管再生的作用。
　　實驗方法:通過劃

15、痕實驗證明Ang1/Tie2信號系統(tǒng)能促進內(nèi)皮細胞的遷移，通過體外小管形成實驗證明Ang1/Tie2信號系統(tǒng)能促進內(nèi)皮細胞的血管管腔形成。
　　實驗結果:實驗結果提示，AS與FNF成纖維細胞條件培養(yǎng)基均能促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成，AS成纖維細胞條件培養(yǎng)基的作用更加明顯。COMP-Ang1以劑量依賴方式促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成，當在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中加入Tie2抑制劑后，內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成明顯被抑制。說明Ang1/Tie

16、2信號系統(tǒng)能促進內(nèi)皮細胞遷移和小管形成。
　　結論:Ang1/Tie2系統(tǒng)通過促進內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成而促進血管再生。
　　第四部分:Ang1通過Notch-1信號通路調(diào)節(jié)血管再生
　　研究背景:我們的實驗研究已經(jīng)證明Ang1/Tie2在AS髖關節(jié)韌帶及成纖維細胞中高表達，并且能促進內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成。然而，目前Ang1/Tie2通過何種信號通路促進血管再生的機制還不完全明確，研究表明在類風濕性關節(jié)炎的滑膜中，

17、VEGF/Ang2能通過Notch-1信號通路共同促進血管形成[1]，也有研究表明，酒精以Notch-1信號通路和Ang1依賴的方式促進內(nèi)皮細胞的成血管活性[2]。然而，Ang1/Tie2信號系統(tǒng)與Notch-1信號通路在調(diào)節(jié)血管再生之間的相互關系并沒有研究。
　　研究目的:本部分實驗旨在研究Ang1/Tie2信號系統(tǒng)與Notch-1信號通路之間的關系，證明Ang1/Tie2信號系統(tǒng)通過Notch-1信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移和小

18、管形成。
　　實驗方法:首先，驗證COMP-Ang1是否激活Notch1信號通路。用不同濃度的COMP-Ang1刺激內(nèi)皮細胞，通過RT-PCR從基因水平檢測Notch-1及其下游靶基因Hey1，Hey2，Hes5的變化，通過Western-Blot從蛋白水平檢測Notch-1受體及其配體DLL-4表達的變化。隨后，COMP-Ang1刺激內(nèi)皮細胞的同時加入Tie2受體抑制劑抑制Ang1/Tie2信號系統(tǒng)，同樣通過RT-PCR從基因水

19、平檢測Notch-1及其下游靶基因Hey1，Hey2，Hes5的變化，通過Western-Blot從蛋白水平檢測Notch-1受體及其配體DLL-4表達的變化。其次，驗證Ang1/Tie2信號系統(tǒng)通過Notch-1信號通路調(diào)節(jié)血管再生，以不同的COMP-Ang1濃度刺激內(nèi)皮細胞，檢測其對內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成的影響，隨后在加入COMP-Ang1刺激內(nèi)皮細胞的同時加入γ分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch-1信號通路，檢測其對內(nèi)皮細胞的遷

20、移和小管形成實驗的影響。
　　實驗結果:不同濃度的COMP-Ang1刺激內(nèi)皮細胞后，Notch-1受體及其DLL-4配體在內(nèi)皮細胞中以劑量依賴的方式表達上調(diào)，其下游的靶基因Hey1，Hey2，Hes5表達也上調(diào)。同樣不同濃度的COMP-Ang1刺激內(nèi)皮細胞，同時抑制Tie2受體后，與無COMP-Ang1刺激組內(nèi)皮細胞相對比，Notch-1受體及DLL-4配體表達無變化，同時其下游的靶基因Hey1，Hey2，Hes5表達也無明顯變化