AngⅡ、Ang(1-7)通過調(diào)節(jié)NOX4-NALP3炎癥體信號(hào)通路對(duì)肺纖維化的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題組的前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，AngⅡ通過激活NOX4/ROS/Rock2信號(hào)通路促進(jìn)原代肺成纖維細(xì)胞的膠原合成，加重博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化，Ang(1-7)可通過抑制NOX4/ROS/Rock2信號(hào)通路的活性減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。然而，AngⅡ及Ang(1-7)對(duì)NALP3炎癥體的影響仍不清楚，AngⅡ能否通過調(diào)節(jié)NOX4激活NALP3炎癥體促進(jìn)原代肺成纖維細(xì)胞的膠原合成，而Ang(1-

2、7)能否通過抑制NOX4/NALP3炎癥體信號(hào)通路減輕肺纖維化的程度。
　　方法:
　　1、體外實(shí)驗(yàn):
　　(1)使用組織貼壁法分離培養(yǎng)大鼠原代肺成纖維細(xì)胞，利用Vimentin免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。
　　(2)檢測(cè)AngⅡ刺激0h、12h、24h、36h、48h后原代肺成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
　　(3)檢測(cè)AngⅡ刺激0h、12h、24h、36h、48h后原代肺成纖維細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平。
　　(4

3、)檢測(cè)不同濃度(10-9、10-7、10-5mol/l) AngⅡ刺激原代肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase1活性。
　　(5)檢測(cè)不同濃度（10-9、10-7、10-Smol/1）AngⅡ刺激原代肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞上清液IL1β水平。
　　(6)免疫熒光雙染檢測(cè)原代肺成纖維細(xì)胞內(nèi)NALP3、caspase1、ASC的表達(dá)。
　　(7) Western blotting檢測(cè)不同處理后原代肺成纖維

4、細(xì)胞內(nèi)NOX4、α-collagenⅠ、NALP3、pro-caspase1、caspase1 p10、IL1β、cleave IL1β蛋白的表達(dá)水平
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　將48只體重約為200g左右的雄性wistar大鼠隨機(jī)分成4組，每組12只:Control組:經(jīng)氣管內(nèi)滴入生理鹽水200μl; BLM組:經(jīng)氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素(5mg/kg); BLM+Ang(1-7)組:經(jīng)氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素（5mg/kg），同時(shí)于皮

5、下埋入裝有Ang(1-7)藥物的微量，泵持續(xù)泵入（25μg·kg-1·h-1）;BLM+AngⅡ組:經(jīng)氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素(5mg/kg)，同時(shí)于皮下埋入裝有AngⅡ的微量泵，持續(xù)泵入（25μg·kg-1·h-1）。4周后取肺組織行NOX4+α-SMA、NALP3+α-SMA免疫熒光雙染，使用Western blotting檢測(cè)NOX4、α-collagenⅠ、NALP3、pro-caspase1、caspase1 p10、IL1β、cl

6、eave IL1β蛋白的表達(dá)水平。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性時(shí)多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性時(shí)多重比較采用Dunnett's T3法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、肺組織貼壁2-4天后可于顯微鏡下觀察

7、到細(xì)胞逐漸從組織塊周圍爬出，原代肺成纖維細(xì)胞形態(tài)呈星狀或梭形，胞質(zhì)透亮，核圓形或橢圓形，核仁明顯，細(xì)胞之間相互連接緊密，邊緣光滑。對(duì)原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞行免疫熒光染色可見細(xì)胞均可表達(dá)波形蛋白（vimentin，成纖維細(xì)胞特有的標(biāo)志性蛋白）。
　　2、AngⅡ(10-7mol/l)分別刺激原代肺成纖維細(xì)胞0、24、36、48小時(shí)后通過western blotting檢測(cè)細(xì)胞CTGF以及膠原（α-collagenⅠ）的合成?？梢夾n

8、gⅡ在24小時(shí)開始即可明顯促進(jìn)CTGF及膠原的產(chǎn)生，且在36小時(shí)的時(shí)候到達(dá)高峰(均P＜0.05)。
　　3、濃度為10-7mol/1的AngⅡ分別作用于細(xì)胞0h、12h、24 h、36h、48 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、H2O2以及NOX4蛋白的表達(dá)。ROS檢測(cè)結(jié)果顯示，AngⅡ處理12h后ROS即可升高，到36h達(dá)高峰（均P＜0.05）。H2O2檢測(cè)結(jié)果顯示，AngⅡ處理24 h后H2O2明顯升高，到36h達(dá)高峰（均P＜0.05）。

9、同樣，通過Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NOX4的表達(dá)，可見24 h時(shí)NOX4表達(dá)明顯升高，到36 h達(dá)高峰（均P＜0.05）。
　　4、AngⅡ處理肺成纖維細(xì)胞后能夠明顯增加NOX4及膠原的表達(dá)，然而，NAC和DPI預(yù)處理細(xì)胞能夠在抑制NOX4的同時(shí)顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞膠原的合成（均P＜0.05）。此外，通過轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA抑制NOX4蛋白的表達(dá)后，可見AngⅡ誘導(dǎo)的膠原合成也同樣是顯著降低的（P

10、＜0.05）。
　　5、免疫熒光染色結(jié)果顯示，AngⅡ刺激肺成纖維細(xì)胞后NALP3炎癥體的各個(gè)組分(NALP3，Caspase1，ASC)熒光強(qiáng)度明顯增高，同時(shí)，熒光結(jié)果顯示，NALP3與Caspase1、ASC與NALP3這兩種蛋白之間相互重合增加。另外一方面，AngⅡ刺激后NLRP3炎癥體的各個(gè)組分(NALP3，Caspase1，ASC)與代表線粒體的藍(lán)色熒光的重合也是明顯增加的，提示線粒體參與了NALP3炎癥體的激活過程。W

11、estern blotting結(jié)果顯示，AngⅡ能夠顯著促進(jìn)NALP3的表達(dá)，同時(shí)，caspase1的活性成分p10、IL1β的活性成分cleave IL1β的表達(dá)也顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　6、AngⅡ處理肺成纖維細(xì)胞后能夠明顯增加NALP3炎癥體各組分蛋白(NALP3、caspase1、caspase1 p10、IL1β和cleave IL1β)及膠原的表達(dá)，然而，caspase1抑制劑AC-YVAD-CMK預(yù)處理

12、細(xì)胞能夠在抑制caspase1 p10的同時(shí)顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞膠原的合成（均P＜0.05）。此外，通過轉(zhuǎn)染NALP3 siRNA抑制NALP3蛋白的表達(dá)后，可見AngⅡ誘導(dǎo)的膠原合成也同樣是顯著降低的(P＜0.05)。
　　7、NAC和DPI能夠明顯抑制NALP3炎癥體各組分蛋白(NALP3、IL1β和cleaveIL1β)的表達(dá)（均P＜0.05）。此外，通過轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA抑制NOX4蛋白的表達(dá)后，可見A

13、ngⅡ誘導(dǎo)的NALP3炎癥體各組分蛋白(caspase1、caspase1 p10、IL1β和cleave IL1β)膠原合成也同樣是顯著降低的（P＜0.05）。
　　8、Ang(1-7)通過抑制NOX4/NALP3炎癥體通路減少AngⅡ誘導(dǎo)的膠原合成。
　　Western blotting結(jié)果顯示，AngⅡ可以明顯誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞α-collagenⅠ、NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白的表達(dá)（均P＜0.0

14、5），聯(lián)合Ang(1-7)處理后，α-collagenⅠ、 NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白表達(dá)水平較單純AngⅡ刺激明顯下降，其作用與聯(lián)合使用AT1受體抑制劑Irbesartan的作用類似(均P＜0.05)。另一方面，聯(lián)合使用Mas受體抑制劑A779能夠阻斷Ang(1-7)對(duì)AngⅡ的抑制作用，使α-collagenⅠ、NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白表達(dá)水平明顯上升（均P＜0.05）。與AngⅡ+

15、Ang(1-7)聯(lián)合組不同，單獨(dú)的Ang(1-7)同樣能夠促進(jìn)NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白表達(dá)水平（均P＜0.05）。
　　9、Ang(1-7)及AngⅡ?qū)Σ﹣?lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的影響。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在BLM組大鼠肺組織內(nèi)，在纖維化形成的肺間質(zhì)中，NOX4蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與αSMA蛋白重疊區(qū)域增多。
　　Westem blotting結(jié)果顯示，BLM組NOX4蛋白較contro

16、l組明顯升高，BLM+ AngⅡ組升高更為明顯，而BLM+Ang(1-7)組較BLM組顯著下降（均P＜0.05）。α-collagenⅠ蛋白的表達(dá)具有相同的變化趨勢(shì)（均P＜0.05）。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，BLM組大鼠肺組織NALP3染色細(xì)胞明顯增多，熒光強(qiáng)度增加，且部分與α-SMA染色陽(yáng)性細(xì)胞共染。
　　Western blotting結(jié)果顯示，BLM組NALP3蛋白較control組明顯升高，BLM+ AngⅡ組升高更

17、為明顯，而BLM+Ang(1-7)組較BLM組顯著下降（均P＜0.05）。Caspase1 p10、cleave IL1β蛋白的表達(dá)具有相同的變化趨勢(shì)（均P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.AngⅡ可通過NOX4激活NALP3炎癥體，促進(jìn)原代肺成纖維細(xì)胞膠原的合成。
　　2.Irbesartan和Ang(1-7)均可抑制AngⅡ?qū)OX4/NALP3炎癥體信號(hào)通路的激活，減少肺原代成纖維細(xì)胞膠原的合成。
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