粘毛黃芩CHS基因植物表達載體的構(gòu)建及其在煙草中的功能驗證.pdf

1、粘毛黃芩(Scutellaria viscidula Bunge)的干燥根是我國常用的中藥材之一，其主要的有效成分黃芩苷為黃酮類化合物。目前市場上的黃芩苷供不應(yīng)求，急需提高它的產(chǎn)量。查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黃酮類化合物生物合成的第一個關(guān)鍵酶，在黃酮類化合物合成代謝中有著極其重要的作用。由于近年來植物基因工程的應(yīng)用蓬勃發(fā)展，因而通過CHS基因工程提高粘毛黃芩中黃芩苷的含量具有重大的實際意義和廣泛的應(yīng)用前

2、景。
　　 本研究是將粘毛黃芩正反義CHS基因構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA1304+上，得到CHS基因正反義植物表達載體，然后通過遺傳轉(zhuǎn)化煙草來驗證CHS基因在黃酮類化合物生物合成中的作用。為獲得高產(chǎn)黃芩苷的轉(zhuǎn)CHS基因粘毛黃芩植株奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下：1.CHS基因正反義植物表達載體的構(gòu)建
　　 PCR擴增得到帶酶切位點BlgⅡ和BstEⅡ的正義CHS基因schs和反義CHS基因achs，回收片段與pMD18-T

3、連接，得到正反義克隆載體pMD18-schs和pMD18-achs。用BlgⅡ和BstEⅡ雙酶切pMD18-schs、pMD18-achs質(zhì)粒及表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1304+，膠回收，將正反義CHS基因片段和載體大片段分別進行連接，建成正反義中間表達載體pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs。采用凍融法將pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA440

4、4。2.農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的CHS基因轉(zhuǎn)化煙草及分子檢測
　　 取煙草幼嫩無菌葉片，剪成約0.5 cm×0.5cm的小方塊，放入制備好的LBA4404菌液中，浸泡5～8 min。用無菌濾紙上吸干多余菌液，放在共培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA)上暗培養(yǎng)48 h。然后轉(zhuǎn)到選擇生芽培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+50mg/LHyg+300 mg/L Cef)上進行脫菌

5、選擇培養(yǎng)，經(jīng)過20 d左右的光照培養(yǎng)，葉片開始分化出抗性芽。待不定芽長到2～3 cm，將其切下放到選擇生根培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L NAA+25 mg/L Hyg+300 mg/LCef)上進行進一步的抗性篩選和生根培養(yǎng)，7天后開始長出不定根。再過二至三周，煙草根系發(fā)達，成苗。結(jié)果獲得轉(zhuǎn)化煙草41株，其中轉(zhuǎn)pCAMBIA1304+-schs(正義)煙草20株，轉(zhuǎn)pCAMBIA1304+-achs(反義)煙草13株，轉(zhuǎn)pCAMBIA

6、1304+(空載體)煙草8株。
　　 在轉(zhuǎn)基因煙草植株有3～4片葉時，進行GUS組織化學(xué)染色，檢測結(jié)果為陽性的植株移栽至溫室。對GUS檢測為陽性且生長較好的轉(zhuǎn)基因煙草植株進行PCR檢測，得到5株陽性正義轉(zhuǎn)基因植株，6株陽性反義轉(zhuǎn)基因植株，3株陽性轉(zhuǎn)空載體植株。選取PCR檢測為陽性且長勢較一致的轉(zhuǎn)基因植株進行RT-PCR檢測，與對照(未轉(zhuǎn)化的野生型植株WT和轉(zhuǎn)空載體植株P(guān)3)相比，正義轉(zhuǎn)基因植株CS3、CS4和CS6的cDNA都能

7、擴增出1170 bp大小的目的片段ochs，而反義轉(zhuǎn)基因植株CA2、CA4和CA6的cDNA均完全不能擴增出目的片段ochs。說明外源正義CHS基因schs在正義轉(zhuǎn)基因植株中已轉(zhuǎn)錄為mRNA，使煙草中CHS基因超量表達；而整合到反義轉(zhuǎn)基因煙草基因組的反義CHS基因achs，抑制了煙草CHS基因的表達。3.轉(zhuǎn)基因煙草總黃酮和蘆丁含量的測定
　　 以分子檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化的野生型煙草(對照)為材料，用紫外分光光度法測定其

8、總黃酮含量，HPLC法測定其蘆丁含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)空載體植株與對照的總黃酮和蘆丁含量均相近；正義轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量都高于對照植株，其中CS4的總黃酮含量最高，比對照提高了4 mg/g DW左右，與對照相比，CS4的蘆丁含量也顯著增加；反義轉(zhuǎn)基因植株的總黃酮含量均低于對照植株，其中CA2的總黃酮含量最低，比對照降低了約6 mg/gDW，與對照相比，CA2中的蘆丁含量也明顯降低。說明，CHS基因的表達量直接影響黃酮類化合物的合成量，它是